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标题:【求助】有关WESTERN BLOT的一个问题

ssonglikihi[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】有关WESTERN BLOT的一个问题


我刚开始做Westernblot，我想请教各位高手转膜以后可不可以不把膜剪开，将目的蛋白的一抗和β-actin一起加入孵育呢？
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plaa[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议你最好剪开！防止非特异交叉反应，如果你觉得是ＭＡＲＫＥＲ就一个涌道的话，你可以在作完的时候在放在一起比对就好了！
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最好不要这样，我刚开始做时也想这样，查了查好象说是加上二抗以后有交叉反应，要用二抗相应的动物血清封闭．要是有ＭＡＲＫＥＲ且目的蛋白的分子量大把膜剪开就行了．
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ssonglikihi[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我还有一个问题，如果跑胶时用的预染marker，目的蛋白的分子量是不是一定与预染marker的标示完全一致，会不会出现偏差。我的目的蛋白的分子量是72-74kd，marker的第二条带是79kd，而第三条带是46kd，我跑出来的蛋白条带是比较接近第三条带的，这可能是我的蛋白吗？还是非特异性反应？谢谢高手指教。
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dog002[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般来说,跑出来的蛋白会比原来预想到的大一些(可能于蛋白修饰有关)
你的蛋白分子量是怎么查到的?
文献中的会准一些,用软件算的话,就不是很准确了
至于它是不是你的目的蛋白,杂交一下不就一目了然了!!
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ssonglikihi[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的蛋白分子量是通过文献查到的，应该比较准确了。怎么杂交呢？具体怎么做能说得明白一些吗？谢谢帮忙！
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c86v[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的蛋白不会在变性的时候亚基分离了吧？查查这个蛋白会不会存在二硫键连接的亚基~~~
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dog002[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你做WB 不是有你目的蛋白的特异性抗体吗?
转膜后一抗孵育2小时
tbst洗3次,每次5分钟
二抗孵育2小时
tbst洗3次,每次5分钟
显色就可以了啊!!
如果是你目的蛋白的话,不就看到了吗?
小一些的话也正常啊
同意楼上的看法
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ssonglikihi[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问你作Western是一天作一批样本吗？还是两天作一批？一抗孵育是恒温37度2个小时吗？我们实验室的同学都是室温一抗孵育4－5个小时。孵育两个小时时间够吗？
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dog002[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是两天作一批,第一天跑胶,转膜,然后封闭过夜
第二天作杂交
刚开始摸条件时是恒温37度2个小时,但是有杂交时,液体挥发问题解决不了,
现在我们这室温也不是很低了(有时能到30度),就室温孵育2两个小时了,效果也不错,我还试过一抗在4度杂交过夜,也出了,我感觉杂交时间不是问题,只要抗体效价高,时间是可以考虑改变的.
ps:室温杂交是也是用摇床在摇的.过夜的不摇,就是放冰箱里了
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