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标题:【求助】 去污剂、还原剂对镍柱纯化的影响？

tudou85[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】 去污剂、还原剂对镍柱纯化的影响？


请教各位大侠，小弟采用NI-NTA纯化6×HIS的融合蛋白，但此蛋白形成的是包涵体，纯化要在变性的条件下进行，为清洗包涵体时可能要用到EDTA、TRITON X-100等等还原剂和去污剂，不知这些会对镍柱纯化及后期蛋白的复性有何影响？
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ffaa[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

EDTA是绝对不能用,金属熬合剂啊,还有还原剂慎用,用的太多的话会把你的镍柱还原的
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-6-19 13:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

以下是Amersham 的His-tag柱子说明书中各种添加剂的上限要求，有一定参考价值：
5mM DTE ； 5mM DTT； 20mM BME；5mM TCEP；10mM reduced glutathione
8M Urea；6M guanidine hydrochloride
2% Triton X-100；2% Tween 20；2% NP-40；2% cholate；1% CHAPS
500mM imidazole；20% erhanol；50% glycerol；100mM Na2SO4；
1.5M NaCl；
还有各种缓冲盐类比如Tris、HEPES、MOPS、sodium acetate都是100mM
另外，EDTA、EGTA等螯合剂尽量避免使用，会将金属离子Ni+等从柱子上结合下来，使柱子失效。（但说明书上介绍有1mM EDTA实验成功的例子，但不能再高了）
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tudou85[使用道具]
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发表于 2014-6-19 13:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢楼上的提醒，但是如果能得到比较纯的包涵体而不加这些还原剂和去污剂呢？TRITON X-100会有影响吗？
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-6-19 13:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

为什么不先用含有DTT和EDTA等的 buffer先纯化包涵体。最后用不含这些试剂的buffer再洗一次呢？这样不就既可以得到纯化的包涵体。又可以去掉DTT和EDTA吗？
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