【求助】蛋白纯化

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标题:【求助】蛋白纯化

TNT[使用道具]
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发表于 2014-6-19 13:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我要纯化一个蛋白，没有标签，破细胞取上清，通过盐析后电泳检测目的蛋白约占30%左右，后上分子筛，现在的问题是洗脱峰就一个，电泳发现我的目的蛋白和杂蛋白都一起出来的，为什么呢？有人解释说可能是目的蛋白和杂蛋白结合在一起了，比如形成了跨膜结构等，不知道大家做蛋白纯化时有没有出现过这种情况。我将溶液pH调至10左右，目的是要尽量打开肽链，后过分子筛，结果还是一样。
请问各位大虾有无高见？

lxh031[使用道具]
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发表于 2014-6-19 13:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用分子筛关键在于你的蛋白和杂蛋白分子量的差距，一般至少需要2－3倍才可以用分子筛。另外要考虑所用凝胶的截流范围、走内水还是走外水等因素。
凝胶过滤就一个峰，说明不能起到分离效果。另外，pH10容易引起蛋白失活甚至变性，通过凝胶过滤并不适合纯化。你可以考虑用离子交换和疏水层析来做。

TNT[使用道具]
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发表于 2014-6-19 13:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢您的回复。
我的目的蛋白分子量11kd，几个主要的杂蛋白都在30-70kd，分子量相差悬殊，并且我用的superdex75的柱子，可分离范围在3kd-70kd，所以我想您说的上面的情况都不是问题。
如果目的蛋白嵌合入杂蛋白，我是希望通过变性来达到将其分开的目的，但现在看来好像仍然分不开。
您说的离子交换和疏水层析又怎样将杂蛋白和目的蛋白分开呢？

mysmdbl[使用道具]
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发表于 2014-6-19 13:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你这个蛋白是用大肠杆菌表达的吧.如果是,我怀疑你的目的蛋白或许和DNA或RNA形成了复合物,这样的话,你用分子筛分离是得不到好的分离效果的.你可以用DNase 处理一下在分离,看有没有效果.
也可以查文献,了解这种蛋白的C端有没有一个和核酸结合的位点.

ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-6-19 13:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 TNT 于 2014-6-19 13:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢您的回复。
我的目的蛋白分子量11kd，几个主要的杂蛋白都在30-70kd，分子量相差悬殊，并且我用的superdex75的柱子，可分离范围在3kd-70kd，所以我想您说的上面的情况都不是问题。
如果目的蛋白嵌合入杂蛋白，我是希望通过变 ...

离子交换是利用蛋白质等电点的不同，在一定pH条件下，蛋白荷电性质的差异，与凝胶结合作用的差异，因此可以通过不同离子强度的缓冲液来洗脱和分离。
疏水层析是根据蛋白质与凝胶的疏水性质来分离纯化的，具体的方法有很多资料可以查阅，当然也要尽可能了解你的蛋白性质。
这两种方法是分离没有亲和标签的蛋白最通用的方法。
凝胶过滤虽然简单，但并不实用，有很多缺陷，耗时长、上样量少，最主要的是分离效果并不理想，一般情况下是不采用凝胶过滤的。
根据你的情况，如果对产物含量要求不高的话，可以把分子筛的范围在缩小一些，让杂蛋白走外水，目标蛋白走内水，应该可以改善。

98776langtao[使用道具]
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发表于 2014-6-19 13:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

就你的目的蛋白和杂蛋白的分子量而言，用superdex-G75分不开，若70kda和11KDa能勉强分开的话，那么30kda和11kda根本就分不开，我以前做过类似实验。如果一定要用凝胶柱，就选G50或G30的，最好在过凝胶柱之前过一个离子柱。

TNT[使用道具]
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发表于 2014-6-19 13:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 98776langtao 于 2014-6-19 13:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

就你的目的蛋白和杂蛋白的分子量而言，用superdex-G75分不开，若70kda和11KDa能勉强分开的话，那么30kda和11kda根本就分不开，我以前做过类似实验。如果一定要用凝胶柱，就选G50或G30的，最好在过凝胶柱之前过一个离子柱。 ...

用superdex-G75分不开，若70kda和11KDa能勉强分开的话，那么30kda和11kda根本就分不开，
从这个柱子的参数来看完全可以将他们分开的吧