蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】大肠杆菌表达3小时量最大，后减小，原因何在？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】大肠杆菌表达3小时量最大，后减小，原因何在？

bluelake[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76389
精华 0
积分 382
帖子 444
信誉分 100
可用分 3046
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-4
状态 离线
1

发表于 2014-6-19 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】大肠杆菌表达3小时量最大，后减小，原因何在？


目的片断克隆到pET载体，转化大肠杆菌，30度、0.1mM IPTG诱导表达，表达成功，量也比较大，试验发现，诱导1、2、3小时后量明显逐渐增大，第4小时时量反而减小，现撰写论文讨论部分，需要与相关的试验做一比较。请问原因何在呢？
顶部
zwsyrt[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79787
精华 0
积分 594
帖子 867
信誉分 100
可用分 5136
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
2

发表于 2014-6-19 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先是你的蛋白量下降的同时菌体（其他蛋白量）是否减少了？
如果也减少了，有以下两种可能。
IPTG有细胞毒性，会抑制菌生长甚至导致死亡，随着时间增长菌会裂解。即使你的IPTG浓度比较低，但随着表达异源蛋白的积累可能会导致细胞毒性，这也会导致菌体破裂，使获得蛋白量下降。
如果总蛋白量没变，只是目标条带变弱了，有可能是异源蛋白激活了菌体的蛋白酶系统，导致蛋白迅速降解。
另外30度表达蛋白，蛋白开始的表达速度会很快，此时蛋白降解速率小于表达速率，但是当蛋白浓度升高以后，蛋白降解速度加快，而表达速度由于细菌活力下降而降低，也会导致目标蛋白浓度下降。
顶部
bluelake[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76389
精华 0
积分 382
帖子 444
信誉分 100
可用分 3046
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-4
状态 离线
3

发表于 2014-6-19 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的情况属于您所讲的第二类。不知您是否有相关的文献？这里我不是怀疑您，而是老板让我找到前人的试验，比较有说服力一些，还请赐教！如果不方便说，请PM我，我一直在线。谢谢您！
顶部
qhyu[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77304
精华 0
积分 705
帖子 1049
信誉分 100
可用分 6111
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
4

发表于 2014-6-19 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

^_^，我个人认为，你不妨加大IPTG量5－10倍，诱导温度提高到37左右，我看对于p ET系统效果会很好。还有我个人比较倾向于用2－3mm的lactose，诱导温和，一般4－7h，诱导量大，不会出现明显的表达量减少。值得一试啊。
顶部
bluelake[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76389
精华 0
积分 382
帖子 444
信誉分 100
可用分 3046
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-4
状态 离线
5

发表于 2014-6-19 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你所说的诱导温和是什么条件呢？请赐教！
顶部
am10[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76183
精华 0
积分 676
帖子 971
信誉分 100
可用分 5735
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
6

发表于 2014-6-19 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

就是第二种情况了,其它的原因都是次要的.
顶部
bluelake[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76389
精华 0
积分 382
帖子 444
信誉分 100
可用分 3046
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-4
状态 离线
7

发表于 2014-6-19 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没有相应的参考文献，说服力始终感觉有点不强啊。
顶部