蛋白质与蛋白组学

总结一下大家的回答，也是我的一点点看法：
1.制胶的问题：严格按照分子克隆上的配方配制浓缩及分离胶。在各组分的液体中，我感觉很重要的是TRIS－CL的配置，不同的浓度，不同的PH值，一定要正确。胶的浓度大些，跑的条带会 好看些，但电泳的时间及电转的时间都会增加。另外 在聚合时间上，一般现在的温度（20度），至少在30分钟以上。
2.上样量不算大，但体积不要太大。办法是：使用浓一些的样品，上样缓冲液可以配成5x的。这样条带会好看一些。
3.电泳时间不是很大问题。因为其取决于你的电压大小，一般均采用恒压，电压越大，产热会多，因此，最好在冰盒内电泳（如果由制冰机的话，不是问题。）但我的感觉是，电压不要太大，在80-100v，跑得时间长一些，结果会好看些。我曾经染过电泳后的胶，确实是这样。
另外，电泳缓冲液很重要，按分子克隆的配方配制，配成5x的储存液，每次使用时稀释到1x的工作液，工作液最多使用2次，也就是说，第一次是新鲜配的，用完后回收，再用一次就弃掉，不要反复用，因为其中的离子浓度已经今非昔比了。注意：配制液体时一般要配成储存液，这样存放时间较长也会比较稳定，而且经用，如果配成工作液，不能长时间存放，且一次配成用不了几次又需要配了，很麻烦。
综上，
1.请按照分子克隆检视自己所配的液体是否合适；－－关键！
2.使胶聚合充分；
3.冰盒中电泳，电压、时间中庸一些，别片面追求时间短。
祝试验成功！
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pH值是对的，聚合时间积层胶和分离胶都分别达到1h以上。
5×上样缓冲液的SDS不会沉淀下来么？
用4×就已经很稠很费劲了啊
电泳是放4度的
而且电泳液原先有预冷
我们也是从5×电泳液稀释用的，最多使用2次
谢谢你的耐心解答，可是你分析的原因似乎都不是问题所在 Sad

我怀疑胶和玻璃板之间有缝隙。我跑了两块10％的，其中一块，出现了异常。但也只是其中几个条带出现了快速下移。
请问：分离胶的灌胶之后，你用什么压的胶，如果是水的话，换成*醇试试（记不得了，查分子克隆）。我有一次用10％的SDS压的胶（应该是0.1％的SDS），结果胶聚合的不均匀。
另外，检查一下配胶时，SDS的用量和浓度是否正确。是否充分混匀，是否用错缓冲液，过硫酸铵和TEMED是否是最后加入的。用量是否不对（有人和我说过，分子克隆的这两个试剂有可能不对，我没有验证过）。玻璃板是否洗净。和周围跑过15％的人对比一下配胶和步骤。
从结果看，是蛋白泳动的不均匀。可能是胶的问题，也可能是胶底部微小的气泡造成。
我怀疑还是胶的聚合不均匀。可能是凝胶的时间不够，也可能是过硫酸铵和TEMED用量问题，或者未充分混匀。也可能是SDS的过量。4度电泳试试。恒压试试。
哦，对了，拔掉梳子后，有没有冲洗一下上样孔？
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如果板和胶之间有缝隙的话，电泳前是可以看到气泡状的东西的
跑的时候从溴酚蓝的形状也可以看得出来
以前跑10％胶的时候也有遇到这种情况
可是这两次都不是那样的
分离胶是用无水乙醇压的，我们实验室一直用这个，应该不存在什么问题吧？
倒掉乙醇后也有用双蒸水冲洗多次，然后吸干水分。
SDS的量在配制缓冲液时反复核对过，没有配错。缓冲液也没错，APS和TEMED肯定也是最后加呀，用量也是反复验证过的，因为跑的胶很难看，所以在配胶的时候特别小心
玻璃板洗得很干净，拔掉梳子后也有冲洗加样孔。
我让实验室其他跑15％胶的同学帮忙配了一板胶，结果跑得也非常难看。
而她跑她的样品跑出来却好看很多
所以我怀疑裂解细胞的buffer不同会不会导致跑胶效果的差异？

0.03A恒流，溴酚蓝跑至底部时，20kd的那道marker还在胶的中间。
箭头标注的条带就是目的条带（17KD）。
在积层胶那部分跑起来还是很正常的，可是到了分离胶就不行了。
溴酚蓝变成很宽的弥散状，下缘是平的，可是上缘弯弯曲曲，丑得不行。
为什么跑出来会这样歪歪扭扭的呢？
是因为上样量太大？可是我以前跑10％的胶，60ug上样量都不会跑成这个样子啊。
已经排除了配胶试剂和电泳液电泳设备的问题。
请大家帮忙分析分析，拜谢~
不知道你配的30％丙烯酰氨的PH质调过了吗？你的电泳缓冲液重新配，并注意它的PH质
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这两个东西没问题

个人以为：
1. 上样量不大，30ug可以，但体积不要超过加样槽的容积。
2.电泳时恒流0.03A有点高，试试20mA吧。
3.注意降温，冷却。
4.用新的过硫酸铵。
5.所有用到的溶液要过滤。最好用高纯水。
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上样的体积不足加样槽容积的1/2
第二次跑胶电流就是0.02A
是放4度电泳的
第二次用的是当天新配的APS
所有溶液过滤也夸张了点吧？

这么歪歪斜斜的胶本人就跑过，后来找到原因 ：5*电泳缓冲液是1年前配的，用新配的就解决了 你的电泳液看了没有？

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因为跑胶跑得多
所以5*电泳液一般不到一个月就会新配一次
电泳液应该没问题
因为同时跑的10%胶跑得很漂亮

buffer 的ＰＨ，样品的盐的含量（，细胞裂解液的成分）是否与核酸混在了一起．，都有可能，，在样品太多的时候这些东西影响特别大，，样品少他们的影响就小一点．．我以前跑胶的时候（１２％，，１５）也出现过这样的问题

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那你后来怎么解决的呢？