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标题:【求助】为什么我15％的胶跑得这么恐怖啊？

JK.jon[使用道具]
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发表于 2014-6-20 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道你的问题解决了没？
你这个问题我也遇到过，
但是我找其他实验室的同学给跑的，
所以原因很复杂，
我个人认为有一下几个问题：
1、我觉得你应该摸索一下AP和TEMED的量，尽量少加。
或者试着换一下，如果加的太多了就会导致胶聚合的不均匀。
2、你可以试试晚上做胶第二天跑胶，这样估计胶肯定充分聚合了。
祝你好运！
问题解决了告诉大家一下。
......

===============================================

我们实验室其它人也有跑15%的胶
虽然也有溴酚兰扩散的现象
但是最后显影出来的条带不会这样歪歪扭扭的
所以我也怀疑过是我配胶的问题
于是拜托那个同学帮我配了一板
结果也跑得非常恐怖
然后我跟上面的战友说的那样，怀疑是buffer的问题
所以就收了同时接的两个板一样的细胞量用不同的buffer裂解
结果都跑得很难看
真不知道该怎么改进了
唉
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remenb[使用道具]
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发表于 2014-6-20 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你试着摸索一下AP和TEMED的量，
尽量少加，
看看怎么样？
跑12％以上的胶一般不好跑，
只要一个环节有问题就跑不好。
我再想不起其他的问题了，
你可以试着换一下AP和TEMED，
祝好运！！
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发表于 2014-6-20 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不嫌麻烦的话 把各个工作液的的配置,
胶中个工作液的比例(具体到多少)都一一写出.
再不嫌麻烦 把整个SOP都写上来,大家一步一步的分析....
关注中。..
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-6-20 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有一个问题大家忽略了，就是你用的LOAGING BUFFER 是你自己配的么 配方是什么 LOAGING BUFFER 配制过程中 如果SDS没有加热 ，很难溶解 ，如果SDS没有完全溶解， LOAGING BUFFER 就很粘稠，电泳时条带就会变形
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发表于 2014-6-20 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我在做SDS -PAGE的时候也遇到过这种问题.我觉得原因可能是:
1样品处理液的问题,你可以在配制样品处理液时先过滤再加甘油.
2压缩胶凝固不均匀.
3玻璃板底部有气泡.
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发表于 2014-6-20 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果你能确定配胶过程没有出错的话，我想应该是样品的问题了。我以前跑过20％的胶时情况跟你的差不多，胶的浓度越高似乎对盐浓度或者上样量越敏感，我的样品里有尿素，咪唑或者PEG，当有PEG时条带变性特别明显。你的目的蛋白分子量是多少的？非得用15％的吗？是否可以用12％的试试？
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2014-6-20 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有一个问题大家忽略了，就是你用的LOAGING BUFFER 是你自己配的么 配方是什么 LOAGING BUFFER 配制过程中 如果SDS没有加热 ，很难溶解 ，如果SDS没有完全溶解， LOAGING BUFFER 就很粘稠，电泳时条带就会变形

================================

loading buffer是自己配制的
成分有溴酚兰，SDS等
都是loading buffer加入离心完的上清中
然后沸水中煮10min
因为是2*loading buffer
所以SDS不难溶
buffer也不粘稠
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2014-6-20 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在做SDS -PAGE的时候也遇到过这种问题.我觉得原因可能是:
1样品处理液的问题,你可以在配制样品处理液时先过滤再加甘油.
2压缩胶凝固不均匀.
3玻璃板底部有气泡.
......

===============================================

1 咋过滤？甘油在我们平时用的loading buffer里面就有啊
2 如果是这个问题的话，怎么解决？
3 这个应该没有
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2014-6-20 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果你能确定配胶过程没有出错的话，我想应该是样品的问题了。我以前跑过20％的胶时情况跟你的差不多，胶的浓度越高似乎对盐浓度或者上样量越敏感，我的样品里有尿素，咪唑或者PEG，当有PEG时条带变性特别明显。你的目的蛋白分子量是多少的？非得用15％的吗？是否可以用12％的试试？

==================================

17KD啊
我今天也在琢磨实在不行就试12%的好了
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发表于 2014-6-20 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的marker条带呢?是不是可以试试光跑marker看看条带是否均一,这样就可以排除制胶等方面的问题?
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