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标题:【求助】丙酮沉淀蛋白问题

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发表于 2014-6-20 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】丙酮沉淀蛋白问题


最近做丙酮沉淀蛋白。过程如下：目的蛋白4ml（溶解于pbs 缓冲液ph7.4中）在搅拌下加入10ml -20度预冷的丙酮（终浓度约70%），-20度沉淀过夜第二天离心，沉淀中很多盐也一起沉淀下来了。
而我上次用丙酮沉淀含100mM的NACL的该蛋白时候却没有沉淀阿 ？不过上次蛋白量比较少
不知道是不是丙酮沉淀时盐也会一起沉淀（我的NACL 137mM）？丙酮沉淀是不是有浓度限制还是有绝对的量的限制呢？请高人指点！
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发表于 2014-6-20 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般丙酮沉淀用量是蛋白液体量的4倍。也就是说你4ml样品，需要加16 ml的丙酮。
另外，低温沉淀会导致盐共沉淀的。你可以试试在室温下沉淀2小时。
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发表于 2014-6-20 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

室温沉淀容易导致蛋白的变性啊.我用4ml蛋白加10ml丙酮可以沉淀蛋白.不过不知道回收率.不过我感觉大部分能沉淀下来吧!您认为丙酮沉淀盐的时候是跟盐浓度关系大还是跟盐的量(当然在能沉淀出来的最小浓度之上了)关系大呢?
我上次沉淀含0.1M NaCl .20mM Tris.cl pH8.0的时候500ul 加1.25ml丙酮沉淀过夜就没有沉淀下来.这次4ml蛋白(在PBS缓冲液中:137mM NaCL 10mM Na2HPO4 2.7 mM KCl 2mM KH2PO4 pH7.4)加10ml丙酮为什么就沉下来了啊?
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蒲公英[使用道具]
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发表于 2014-6-20 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

丙酮可以用透析的方法出去么??
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发表于 2014-6-20 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用透析那还不如用离心倒掉来得快啊!
不知道您说的透析是怎么操作的?
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发表于 2014-6-20 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用透析那还不如用离心倒掉来得快啊!
不知道您说的透析是怎么操作的?
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 小中大

我沉淀的蛋白是多肽。只有5kd
应该还好。沉淀的蛋白用水可以溶解一半左右。剩下的还是没有办法溶解。你一般用什么浓缩阿？用PEG怎么样啊？我的不能用浓缩管。太小了。比较危险啊。硫酸铵沉淀还得除盐，而且小肽硫酸铵沉淀也不知道效果怎么样啊？。损失可能也大
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发表于 2014-6-20 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的蛋白太小了，用超滤浓缩管不是很好做。要是丙酮不会引起你的蛋白变性，还是不错的方法。终浓度70%的丙酮效果还是不错的，引起盐沉淀的原因可能是你的沉淀时间太长了，减少时间会好些。2h，－20度基本上就够了。
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 小中大
我会试一下的.不过我的蛋白丙酮沉淀之后可以用水溶解一部分.溶解的应该是没有问题的吧?我是要测该蛋白的活性的.所以我也不知道水溶解的有没有问题.要试了活性才知道呢
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