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标题:【求助】酵母双杂交紧急求助!!

daod[使用道具]
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发表于 2014-6-20 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】酵母双杂交紧急求助!!


酵母双杂筛库共转化后，一个酵母克隆中可能含有不止一个AD的质粒，在这一步大家是如何让多个AD质粒分离的？是按照系统3的说明书来做的吗？那需要X-a-Gal，我没有买，我的显色试验是用Colony-lift Filter Assay来做的，用的是X-Gal。在这一步我该如何做呢？这个步骤是否是必须要做的呢？因为系统2的说明书中并没有提及这一点，但我认为这个问题在酵母中普遍存在，所以在系统2中也不例外，不做的话对后续试验影响有多大呢？敬请高手指点！！此外，酵母质粒转化大肠杆菌一定要用电转吗？CaCl2法肯定转不进去吗？我这里没有电转仪怎么办呢？
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2014-6-20 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如何让多个AD质粒分离：我以前做的时候是多次划酵母单克隆平板外加x-gal 检验，也就是不断稀释，直至确定每一个酵母里面只含有一个AD的质粒。
用x-gal：这得由你的报告基因系统来决定。
用电转还是钙转：电转的效率要比钙转高很多，而一般双杂交酵母里的质粒都是低拷贝的，从中抽提出来的质粒量很少。我用的是电转，每次长出来的克隆都不是很多；没有试过钙转，你可以先试一下，不行的话就用电转了。
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发表于 2014-6-20 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

让AD质粒分离这个过程是不是挺长的呀？如果阳性的克隆较多的话，这一步的操作就很费功夫了。请问你是如何操作的呢？是划-Trp/-Leu双缺板，然后将长出的克隆在滤纸上进行显色吗？还是用X-a-Gal在培养皿中就直接进行显色？
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2014-6-20 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是划3缺板，这样就能把杂的AD质粒ko掉了，我当时做的时候稀释了两轮，另外一个师兄他只做了一轮就已经很纯了。x-gal检测是更进一步的确定留住的阳性AD质粒。我是在滤纸上显色的。
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daod[使用道具]
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发表于 2014-6-20 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上的战友，再请教一下,如何判断是否纯了呢？我这样的想法不知道对不对？滤纸上显色时是把划板长出的所有克隆都涂到滤纸上，如果显色全都还是蓝色的话就继续再划一轮直至出现白色克隆，表明已经分开了。这里有两个问题：
1. 划板时，当全都还显蓝色时，应该挑哪一个克隆继续划板？还是都挑？
2. 因为酵母中的AD质粒可能不止一个，是否有那种可能，即使有白色克隆出现了也并不代表酵母中就只有一个AD质粒了？
我还没做过，也许问的问题偏颇，望见谅。
期待你的回答！！
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发表于 2014-6-20 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果你还没有做到这一步的话,我建议你买X-a-Gal,省时间又省力气,很快就会变蓝的,如果你在三缺上挑的克隆,假阳性是很高的.
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daod[使用道具]
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 小中大

楼上说的有理，我使用的x-gal,可能相对于你所说的x-a-gal是比较麻烦了一些。我的Y2H系统说明书上就是用的x-gal来检测其中一个报告基因的表达，也就是确保两个相互作用的蛋白的存在。就按部就班了！
使用三缺板就是为了给予一个选择压力把杂的AD质粒淘汰掉以达到纯化的目的，纯化完一轮后，我们是把质粒抽出，转到E.coli里面选择扩增，在每个平板里面平行地挑出3个克隆进行酶切、电泳，如果3个酶切产物的条带大小一致，我们就认为得到的AD质粒是比较纯了的，拿到的质粒便可直接测序；反之不纯，需要进一轮纯化。
写了一堆，不知道能不能帮你解决疑问。可能还会有更方便快捷的方法的。
这也是我以前做Y2H时碰到的问题，映象很深刻，当时也是向园子里面的朋友求助的。呵呵^_^
希望你实验能够顺利！
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