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标题:【求助】酵母双杂交

bananapeople[使用道具]
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发表于 2014-6-21 09:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】酵母双杂交


我现在在进行酵母双杂交筛选，我用的是Clontech的系统3。为了不丢失低亲和力的相互作用，我想先采用中严谨度筛选，然后再进一步在四缺板上筛选Ade的表达，但我没有做过，不知有否战友做这个实验时，按这个流程走过，希望得到大家的帮助，给我点建议。
此外，用AH109菌株时，大家一般都加3-AT吗？筛库时150 mm的培养皿所需的个数怎么确定呢？一般需要多少个？我的文库是从Clontech买的文库，滴度大约是4.2X10 8
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bananapeople[使用道具]
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发表于 2014-6-21 09:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
太感谢了！自激活我正在做。我还想问一下，按说明书上写的，三缺板上筛选后，“replica plate" His阳性克隆到四缺培养基上是如何操作的呢？也是将长出的克隆全刮下来混匀后再涂到四缺板上吗？
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eve_49[使用道具]
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发表于 2014-6-21 09:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你可以同时将三缺、四缺铺上，如果直接在四缺上长了，就直接对其进行蓝白筛选，这样可以节省时间。如果你刮下三缺的克隆，浓度问题很难把握，要是四缺上全长的是同一个蛋白也很麻烦，所以直接配合以后铺三缺和四缺的板子就行。
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uuooii[使用道具]
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发表于 2014-6-21 09:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
肯特，你好！我也在做Y2H，用clotech的Library construction and screening kit，但是遇到好多问题，具体情况如下，酵母双杂交共转化在三缺板上长出克隆，挑取这些克隆连续在四缺板上划线培养三次，生长大小、颜色均正常，提取酵母质粒转化大肠杆菌，在氨苄板（AD载体抗amp、而BD载体抗kan）上筛选得到克隆，测序结果却为诱饵载体。诱饵载体是kan抗性的，而在氨苄板上也能正常生长，原因不明，还请大家帮忙分析一下。
接着又做了一次，选择四缺板上的克隆提质粒，转换大肠杆菌后用T7测序，结果公司说测不出来。急得我不行，还望kent指教！
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轰轰[使用道具]
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发表于 2014-6-21 09:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

自激活已开始就做过，并没有检测到诱饵载体自激活
另外转化的时候铺板了吗,如果不纯,你可以多铺几块板。
这里铺板指的是四缺板吗？我铺20个四缺，20个三缺板还不够吗？
挑取单克隆进行摇菌？这里的单克隆指共转化后在三缺或四缺上长的克隆吗？我以前也挑过，不过在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp液体培养基中摇菌，是不是错了，应该在YPDA中摇？
提完质粒后用BamHI 进行酶切鉴定，
我在pGADT7-Rec上看应该是Hind III啊？
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zhangHhong[使用道具]
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发表于 2014-12-9 10:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

酵母双杂交Yeast mating

Yeast mating: 最近一直在做酵母双杂交筛选与目的基因相互作用的蛋白，之前做出过两次，筛出了一些蛋白，可最近怎么做都筛不出来，具体遇到的问题是：a.酵母在四缺板子上生长比较快，大概两天就能长出来。
b.筛文库时，之前两次原液涂五十个板子上能长30个左右，现在是原液稀释100倍，在一个四缺板子上都能长满板。
c.将四缺上再筛过后的菌斑提质粒后，测浓度能达到20-30ng/ul,但是转化到大肠杆菌DH5α A+和K+抗性平板上却什么都长不出来。
求高手指导下到底是哪里出问题了。。。十分感谢！
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xiaohuili1323[使用道具]
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发表于 2015-5-14 13:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #3 kent 的帖子

您好，我刚刚开始做酵母双杂，遇到些问题想请教您。。我是用一个bait筛选一个Library，AH109和Y187mating之后涂板。。我本来打算先在二缺+底物筛，再到四缺+底物筛。但是现在涂了二缺的大板子，就很浓，背景一片灰，有的一片蓝，没法挑单克隆啊。。是这个筛选策略有问题还是涂得问题啊？要稀释多少倍涂吗？这可在呢么办啊？望能和您进一步交流，请您赐教。我的qq 799980896,谢谢！
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