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标题:【求助】WB转膜转不上

zranqi_1[使用道具]
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发表于 2014-6-21 10:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】WB转膜转不上

我做细胞的WB，分子量分别是40和80的，胶都跑得不错，可就是转膜转不上。我用的是半干法，转移缓冲液的配方是：48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇。开始用10％的胶，转80mA稳流，60min，第一次转得还行，可以后怎么都转不出来了，转过膜的胶染色后还有很多残留；后来变为8％的胶，按膜面积计算的电流（0.8mA/cm2），转了60min，头一两次转得还行，用立春红染色还算明显，但后来却怎么都转不出来了。用的还是同样的试剂，同样的蛋白样品，怎么就重复不出来呐？请教各位高手，究竟是怎么回事？
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3N4G[使用道具]
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发表于 2014-6-21 10:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

电极有没有断路，或仪器出现了什么问题？
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发表于 2014-6-21 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用的是同一批膜吗
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发表于 2014-6-21 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1)如果你用的是国产的膜,要注意正反面,一般是光面的为正面,要将正面对着胶;
2)分子量为40和80用10%的胶应该是没有问题的
3)你的正负极有没有弄反?
4)膜的大小应该超过滤纸,否则易短路
5)你的转移缓冲液有无配错?次数不能用太多,一般最多3,4次
6)可放冰了?
7)可加长转的时间.用一个半小时看看
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发表于 2014-6-21 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

胶与膜之间不要存在气泡,这是转膜的最起码要求
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发表于 2014-6-21 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Is there a special reason that you have SDS in the transfer buffer? I have never seen a reciepe like this. I think this is the problem!
Good luck
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2014-6-21 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做“三明治”时膜胶之间有起泡的话，气泡在胶-膜之间引起的绝缘区使蛋白无法通过而不能到达膜上，这一步在操作时尤其要小心，我自己犯过，也看到其他人犯过。我的办法是把胶铺到膜上，先使其一边接触膜的一边，这样就会在胶和膜交界的地方形成一个水相前缘，然后慢慢落下凝胶，这样这个水相前缘就会逐渐推进直至胶膜重合，如是则不会有气泡产生。把胶铺到膜上而非相反是因为胶是透明的，可以看到水相前缘以及有无气泡产生。
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68943512yao[使用道具]
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发表于 2014-6-21 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

既然以前能转成功,我想楼主的操作不会有太大的问题.我觉得飞翔的理由分析的很对,你可以再试试.我们的转移buffer一般只用一次,还有就是转移的膜要小心的存放,注意正反.希望对你能有帮助
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