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标题:【求助】]今天刚做的二维结果，问题出在哪里？

mamamiya[使用道具]
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发表于 2014-6-21 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个是18cm的标准，13cm不用这么长。
我们用的是干胶条，一般20小时左右不会有损坏。
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ROSE李[使用道具]
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发表于 2014-6-21 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的电泳设置可以在2000v,4000v再设置step,即30v，12h；500,1h；1000,0.5h；2000v,0.5h,4000,0.5h,8000v，4h.
这样设置是因为前面几个step是为了进一步去除胶内离子,同时促聚.一般来说再1000和2000的时候要调控,如果8000时每根gel的电流不能超过55ua的话.4000升8000的时候电流就不能超过27ua.以此往前推,所以在1000和2000的时候看电流降的不够低就要再增加0.5h,让离子尽量跑出去,电流降下来.关键是要保证能上到8000,同时保证8000v4小时的高压聚焦.这样总vh差不多答道40000vh.
还有就是你的上样量时有点少.我可以答道1.2mg的
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chengjie79[使用道具]
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发表于 2014-6-21 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的电泳设置可以在2000v,4000v再设置step,即30v，12h；500,1h；1000,0.5h；2000v,0.5h,4000,0.5h,8000v，4h.
这样设置是因为前面几个step是为了进一步去除胶内离子,同时促聚.一般来说再1000和2000的时候要调控,如果8000时每根gel的电流不能超过55ua的话.4000升8000的时候电流就不能超过27ua.以此往前推,所以在1000和2000的时候看电流降的不够低就要再增加0.5h,让离子尽量跑出去,电流降下来.关键是要保证能上到8000,同时保证8000v4小时的高压聚焦.这样总vh差不多答道40000vh.
还有就是你的上样量时有点少.我可以答道1.2mg的
......

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呵呵，很感谢楼上站友的详细解答。我下次的时候试试你的一维参数，不过你能告诉我为什么加了1000,0.5h；2000v,0.5h,4000,0.5h就能壤离子跑出去吗？谢谢
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chengjie79[使用道具]
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发表于 2014-6-21 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这么多天之后，经过了很多的改进结果是有点进步但是还是有不少问题还是要请教各位高手阿！过程大致如下：一维总的伏小时56000,觉得时间应该是够了然后裂解液呢是urea，ultraurea，chaps，dtt，现在明显点是多起来了但是从结果上来看还是有两个问题没有解决。一个是阳性端的横向脱尾还是很严重，另外一个是点还是不太清楚好像聚焦还是不够？我这次的裂解液的配方是这样的：urea , ultraurea ，chaps，然后是1000ul的泡胀液中加 5ul的IPG BUFFER，dtt现加。裂解后基本没有沉淀，我觉得裂解应该是蛮充分的了，18000离心后上样！步骤基本上我已经很熟练了我觉得问题应该还是出在样品处理和一维上吧！您看我现在的问题出在哪呢？


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2014-6-21 10:40
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yonger[使用道具]
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发表于 2014-6-21 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从背景看有点脏，但胶条以外的胶并不脏，我感觉还是样品制备或一向出问题了，应该不是银染的问题
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chengjie79[使用道具]
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发表于 2014-6-21 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

胶我觉得还好了，我自己感觉是样品制备的问题不知道其他同学有什么建议吗我做的是平滑肌细胞！
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