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转自 cuturl('http://drugfocus.net/viewthread.php?tid=2361&extra=page%3D7')
我们在利用质粒进行表达目的蛋白的时候,是否遇到这样的情况:以前表达的菌株现在不表达了,是什么原因引起的?
估计原因也很难说清,我在看一本书时,发现有一段讲的挺好,就给翻译过来了.如果大家觉得有问题,我们可以进行讨论
质粒是一种游离于染色体外的、位于细胞浆中、能自我复制的DNA组件，可存在于原核和真核细胞中，常被用于重组基因表达的分子载体。由于其操作简单，当利用原核细胞作为宿主时，质粒表达系统最为常用.质粒的拷贝数由质粒，宿主和培养条件共同决定，一般情况下，主要由拷贝数控制基因决定，拷贝数多的能达到200.
质粒的存在加重了宿主的负担，因为宿主的资源被用于质粒的复制和质粒编码基因以及目的蛋白的表达，当插入基因长度越大，温度越高，表达水平和目的蛋白的产量越高以及目的蛋白对宿主的毒性越大时，宿主的代谢压力越大。这种代谢压力常常导致含有质粒的宿主细胞生长速度降低，同时拷贝数越多，压力越大，因此，随着有质粒的细胞生长缓慢而无质粒的细胞生长不受影响，最终导致培养中含有大量无质粒的宿主。质粒的丢失是目的蛋白产量降低或者不表达的主要原因.
无质粒细胞如何产生?细胞分裂过程中，质粒的不平均分配导致了无质粒细胞的产生，称为质粒分离不稳定性，子细胞中质粒的拷贝数取决于母细胞质粒拷贝数和分裂时的随机分布。如果母细胞中质粒拷贝数高（大于10），无质粒子细胞出现的可能性就非常低。另一个加速无质粒细胞形成的因素是质粒的多聚化，由于质粒含有相同的基因序列，他们可以重组形成一个环，含有2个复制子，这种多聚体导致分列到子细胞中的质粒更少，增加了质粒丢失的可能性，另外，含有质粒多聚体的细胞即便拷贝数一致，其生长慢于质粒单体的细胞。其他影响质粒稳定性的因素由质粒大小，是否存在外源DNA，细胞生长速度，营养丰富程度，温度，培养的方式，这些将在以后逐一讨论。
质粒的结构不稳定性是目的基因表达丢失的另一重要原因。质粒的基因结构重组，形成一个不表达的质粒，这种现象少于分配不均一性造成的不稳定现象，且不能通过选择压力来预防，相反，在外源基因的表达时存在***度的阳性选择压力能够诱导结构不稳定性，结构不稳定性可以导致目的但白不表达或者产生无用蛋白（氨基酸序列上存在小的变华，如缺失，插入，替代），后一种现象危害更大，因为它的出现没有任何表现，选择标记没有改变，不易察觉，必须要进行测序才能发现。
再者，在质粒为基础的表达系统中，一个重要的方面是质粒的拷贝数，尽管，高拷贝一般会提高重组蛋白的产量，但这也不是每次都正确。例如，高拷贝能提高蛋白表达的速度，形成蛋白聚集，缺少正确的翻译后修饰，高拷贝的质粒也可能导致目的蛋白产量很低，可能是翻译效率低造成的，因此，不同的表达应选择不同的表达册列，像用于基因治疗的DNA产品，我们首选高拷贝.
