【求助】原核表达的怪事 - 经验共享

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标题:【求助】原核表达的怪事

莲花白[使用道具]
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发表于 2014-6-21 10:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有可能是你的电泳胶不能有效地分离你的目的条带，因为14KD已经接近SDS－聚丙烯酰胺胶的分离下限了，建议你可以用tricine胶来试一下，上层4％，中层10％，下层16.5％分离14KD效果绝对比SDS-PAGE好很多。

xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2014-6-21 10:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想应该从几个方面考虑:
1 你表达的这个蛋白有没有特殊性质,如毒性或蛋白酶活性等?
2 你用的质粒载体表达元件有没有问题，譬如说自主复制序列和启动子区有没有突变?
3 你转质粒后的工程菌株做过什么验证?平板抗性筛选后有没有菌落PCR验证? 有没有质粒丢失现象?如果光有平板抗性筛选,建议涂感受态做对照.
4 更换表达载体和感受态再做一次。

lgm[使用道具]
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发表于 2014-6-21 10:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢，我用的使15％的胶啊。还有那些问题我也有考虑啊。最近在重复。

NBA[使用道具]
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发表于 2014-6-21 10:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有可能是你的电泳胶不能有效地分离你的目的条带，因为14KD已经接近SDS－聚丙烯酰胺胶的分离下限了，建议你可以用tricine胶来试一下，上层4％，中层10％，下层16.5％分离14KD效果绝对比SDS-PAGE好很多。

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这种三层的胶是直接用上述的浓度来配吗？能不能发一张电泳效果图上来看看呀

lgm[使用道具]
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发表于 2014-6-21 10:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对啊,我也想看看.还有其中的配胶缓冲液是用什么呢?

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