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标题:【求助】pic9k毕赤酵母表达求教！

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发表于 2014-6-21 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】pic9k毕赤酵母表达求教！


我在做酵母表达时遇到了困难，试过表达2个蛋白但都没表达出来，所以怀疑可能自己操作方面存在问题，或者是忽略了某个比较关键的问题，自己又找不出原因，非常苦恼。我把过程一步步列出来，请大家帮我看看，非常感谢！
1．  克隆构建：我的目的片断插在XhoI和EcoRI之间( a信号肽通过PCR获得：BamHI-a factor signal-sequence-XhoI；XhoI-目的基因-EcoRI；载体用BamHI和EcoRI来切得到BamHI-pic9k-EcoRI；最后做3个片断的连接即可)，测序结果正确，读码正确
2．  质粒用SacI酶切，用PEG/LiAc转入GS115后涂MD板，每1ug质粒约长60个左右克隆；pic9k空载做对照
3．  3～4天以后挑克隆至YPD培养，1～2天后抽基因组，PCR鉴定（一侧引物用目的基因上的；另一侧引物用载体上的5’AOX或3’AOX）, 基本上挑到的克隆有70％～100％都是阳性的），选4～5个克隆进行表达
4．  未进行表型筛选，SacI线性化以后转到GS115的应该都是Mut＋
5．  表达培养基用的是BMGY(25ml)和BMMY(50ml)，6～8层纱布封口，磷酸钾缓冲液pH为6.0，每24小时加甲醇至浓度1％且取样1ml，144h后收菌
6．  菌液离心后取上清，取200ul用甲醇/氯仿法浓缩样品后电泳，western检测，杂带较多但上清与沉淀中均检测不到目的蛋白（沉淀破菌用的是玻璃珠和反复冻融法相结合，但是常常破壁破不好，western结果杂带多且条带不清楚）
7．  另外，我想问一下，我的一个蛋白分子量是37kD，软件分析PI为7.2；另一个为18kD, PI9.4。我看到论坛上说pH可能是表达的一个因素，那我如何来优化这pH呢，我原来用的6.0也都避开了这两个蛋白的PI。大家能帮我推荐几个pH值来试试么？
以上是我实验的大致过程，我想2个蛋白都没有表达应该不是偶然，请大家给予指正，不慎感激！
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发表于 2014-6-21 10:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转化后含有了目的基因,理论上说是可以表达的,但是实际中经常不表达,要多筛,我当初表达的时候,开始没有,后来筛出来了.表达量很高,不用浓缩,直接电泳,考染就能看见,
以前有人作过这2种蛋白在酵母中的表达吗?你的方法没有问题,我当初是利用PIC9和PIC9K两种质粒配合使用来解决XhoI酶切位点问题的.个人观点,供参考
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发表于 2014-6-21 10:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢！以前没有人作过这2种蛋白在酵母中的表达；我还想问一下，你大概筛了多少克隆才筛到的？
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发表于 2014-6-21 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我记得是用96孔板筛选的,那就是N*96了吧,好几百个吧
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发表于 2014-6-21 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不是很明白，你是好几百个都表达了以后，做ELISA进行筛选的么？
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发表于 2014-6-21 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好象是的,我现在不记得了,当时作了很多筛选
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发表于 2014-6-21 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我一般是将带有目的基因的表达载体电转化酵母GS115或SMD1168后，在MD板上都能长出至少400个以上的转化子，但是我没有进行表达实验，而是继续G418不同浓度的筛选，所以每次筛选至少要一个星期的时间左右，很多时候筛选到的高拷贝的可能都能进行表达，只有少数部分由于蛋白的原因，表达量很低而已。对了，你再检查一下你的目的蛋白上是否存在两个相邻的碱性氨基酸，如果有的话，你的表达就比较困难了。个人看法，仅供参考。
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发表于 2014-6-21 10:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

毕赤酵母不能用LiAC转化的啊？怀疑你是怎么得到那么多重组子的，毕赤只能用Licl转化或者电转化，或者原生质法。
如果你真的是用LiAC转化得到的重组子，我怀疑你的所有转化子都是假阳性，你是用MD板筛选的么？
说明书上有重点提示，毕赤不能用LiAC，我就吃了这个亏了，呵呵，希望对你有帮助！
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uuooii[使用道具]
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 小中大
非常非常感谢！因为我们实验室做酵母双杂用的是LiAc，所以我就直接用了他们的protocal,根本就没看到手册上的重点提示，我总算是找到原因了。
不过还想再问一下，为什么毕赤酵母不能用LiAC转化啊？是不是用LiAC转化的话，可以将DNA重组进去，但是就杀死了毕赤酵母或者是改变了她的什么性质以至于不能再表达吗？
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-6-21 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以用LiCL来代替醋酸锂，不过转化效率也十分低下，最好的方法当然还是电转化方法，步骤简单，而且效率很高，一个平板可以长到几百甚至上千个阳性克隆，用LiAC法来做酵母双杂交，恐怕效果不会好吧
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