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标题:【求助】请各位战友帮我分析一下蛋白总量测定中的...

yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请各位战友帮我分析一下蛋白总量测定中的...


我现在要测定24孔板孔板中细胞的总蛋白量（蛋白量越多＝细胞数量越多）。现在有两种方法，大家看哪种更准确些。
方法1：去除培养基后PBS洗2次，然后不消化，直接用裂解液裂解细胞，然后用BCA法测量。
该方法会不会细胞裂解不全，造成实验误差？？另外，用什么裂解液较好？因为样本除了做总蛋白，还要做ELISA。
方法2：去培养基后清洗，用EDTA＋胰酶消化，消化完全后终止，然后离心收集细胞。用PBS冲洗后再次离心，重复2次。最后加入50ul PBS，然后冻融3次，最后用考马司亮蓝法测定。
该方法成本低点，但是我做了预试后觉得离心的过程中会有细胞丢失，而且如果胰酶没有洗干净的话也会影响实验结果。
大家平时实验中都是如何操作的啊？？还有什么更好的方法？因为刚刚接触这方面的东西，请各位战友多提宝贵意见，多谢了！
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发表于 2014-6-21 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我最近也在做细胞提取蛋白和蛋白定量实验,也有一些问题,大家一起来交流.
除了以上你说的两种方法还有一种方法就是刮细胞.但是需要把握好刮细胞的力度.以前曾经用过,还可以.把细胞刮下来(冰上操作),离心后用PBS冲洗,再离心,加细胞裂解液RIPA BUFFER,4度冰箱1小时.效果还可以.
关于选方法,各有利弊,需要自己尝试.
最近做蛋白提取实验,(与以前不是在一所学校).RIPA BUFFER 和考马斯亮蓝都是自己配的.在刮细胞可能力度没有把握好,可能刮过头了,以至于离心后看不见什么细胞, PBS冲洗后,加RIPA BUFFER,也能使考马斯亮蓝颜色发生改变.开始还很高兴,突然我想试试只有RIPA BUFFER,考马斯亮蓝变化,发现居然也能变色.
我想问问大家,你们配的细胞裂解液能否引起考马斯亮蓝变色?
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

裂解液中的成分与考马斯亮蓝有干扰，推测可能是triton，所以裂解后最后不要用考马斯亮蓝法测量，可以用BCA法。这是实验室老师给我讲的，具体我自己也没有试过。
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flower-201[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我试了两种方法，用胰酶消化下来后加裂解液及直接加裂解液用细胞刮刮。我的感觉是直接加裂解液用细胞刮效果更好些，刮时尽量用力，同时用枪吹吸让裂解液充分浸润，全部过程在冰上操作。
裂解液能引起考马斯亮蓝变色，我查看过相关资料，提示样品中巯基乙醇的浓度可高达1M，二硫苏糖醇的浓度可高达5mM。但受略高浓度的去垢剂影响。需确保SDS低于0.1%，Triton X-100 低于0.1%，Tween 20, 60, 80低于0.06%。（可参考cuturl('http://www.beyotime.com/bradford.htm')）。
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u234[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
裂解液提取总蛋白时非常粘稠，该怎么处理呢？我们比较穷，舍不得买DNA酶和RNA酶，请问两位都是怎么处理的？
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我试了两种方法，用胰酶消化下来后加裂解液及直接加裂解液用细胞刮刮。我的感觉是直接加裂解液用细胞刮效果更好些，刮时尽量用力，同时用枪吹吸让裂解液充分浸润，全部过程在冰上操作。
　　……

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再请教一下，加了裂解液后可不可以不用细胞刮了？？因为我的细胞长在材料上，材料的表面不平。另外裂解后蛋白不是已经融解了吗，为什么还要用细胞刮呢？？？
请赐教！
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今天试了试反复冻融法，感觉还不错。
具体是：PBS洗过后，加裂解液适量，摇匀，覆盖培养器皿。置-80度冰箱，冻10分钟，取出室温融化。再放置于-80度冰箱10分钟后，取出融化。
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发表于 2014-6-21 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
裂解液提取总蛋白时非常粘稠，该怎么处理呢？我们比较穷，舍不得买DNA酶和RNA酶，请问两位都是怎么处理的？

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我是收培养的细胞。很少有粘稠的状况。可能有两个原因：细胞数相对较少、边裂解边吹打。吹打可使DNA断裂而减少粘稠度。若是组织将组织块尽量剪小，用一次性的针头用劲吹打也有效果。当然最简便的方法是用超声.
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orangecake[使用道具]
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 小中大
再请教一下，加了裂解液后可不可以不用细胞了？？因为我的细胞长在材料上，材料的表面不平。另外裂解后蛋白不是已经融解了吗，为什么还要用细胞刮呢？？？
请赐教！

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用细胞刮是因为细胞是贴壁生长的，而我们加的裂解液往往较少，不刮仅是吹吸的话会有很多的损失。
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发表于 2014-6-21 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

triton确实可以影响考马斯亮蓝，使读书变大，去年我测蛋白浓度是特意翻了书，是什么原理我忘了。
我的方法是对照管也加等量的裂解液，另外标准曲线也要重新用加了裂解液的做。
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