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标题:【求助】蛋白脱盐浓缩的好办法

am10[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
超滤收率低的几个原因：
蛋白浓度低，吸附严重；或膜亲水性差
孔径不合适，导致蛋白损失在透过液；
buffer条件不合适，盐浓度/pH使蛋白沉淀；
过度浓缩，膜表面浓度过高导致失活沉淀；
流速过快，泡沫严重
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发表于 2014-6-21 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想问一下,peg包埋会不会对蛋白活性和结构有影响？我一直用冷冻干燥浓缩，很慢。磷酸缓冲液中的磷酸钠属于蛋白质中的盐吗？
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am10[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果是用的磷酸缓冲液洗下来的蛋白，我建议还是选择用脱盐柱脱盐,从我们的实际情况来看,透析时间都比较长!
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发表于 2014-6-21 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用透析袋透析除盐，完成后将透析袋埋在PEG中，进行浓缩
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天蝎座[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问一下,peg包埋会不会对蛋白活性和结构有影响？我一直用冷冻干燥浓缩，很慢。磷酸缓冲液中的磷酸钠属于蛋白质中的盐吗？

===============================================================================================================

你想问的问题我也想问啊,但是磷酸钠肯定是属于蛋白质中的盐,PEG包埋的损失好象也很大,透析膜也会吸附许多的蛋白,而且一定要选择合适分子量的PEG不然PEG会漏进去;
你一直用的冷冻干燥我也想用,但是担心对蛋白的活性有影响,请问:你有在冷冻干燥前加保护剂吗,比如甘露醇什么的;你是把蛋白冻成干粉再溶解(这样会不会因为蛋白的盐浓度太高而不容易溶解啊),还是留有部分液体以浓缩液的形式保存啊(这样又有冻融的危险哦),我在可真是前怕狼后怕虎啊,呵呵
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发表于 2014-6-21 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
超滤收率低的几个原因：
蛋白浓度低，吸附严重；或膜亲水性差
孔径不合适，导致蛋白损失在透过液；
buffer条件不合适，盐浓度/pH使蛋白沉淀；
过度浓缩，膜表面浓度过高导致失活沉淀；
流速过快，泡沫严重
......

===============================================================================================================

那不就是浓度高了也不行,低了也不行啊,我这是总蛋白,后面要做DNA结合实验的,所以很担心蛋白失活,我选择的膜孔径是截留为10KD的,离心速度在PROTOCOL上有固定值啊,这个快慢又如何去确定呢,能不能推荐哪个公司的产品亲水性比较好,我用的是是MILLIPORE的,但是觉得效果不大好哦
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天蝎座[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感谢各位杂这里献技献策,但是我还有一个比较笨的问题想问,不同的蛋白的溶解度应该不同,那我们这个浓缩究竟有个什么样的浓度底线才能使总蛋白中的有尽量多的蛋白啊
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果蛋白浓度低,就先取大量样品冻干;然后少量Buffer溶解后透析/或上除盐柱?
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问一下,peg包埋会不会对蛋白活性和结构有影响？我一直用冷冻干燥浓缩，很慢。磷酸缓冲液中的磷酸钠属于蛋白质中的盐吗？
你想问的问题我也想问啊,但是磷酸钠肯定是属于蛋白质中的盐,PEG包埋的损失好象也很大,透析膜也会吸附许多的蛋白,而且一定要选择合适分子量的PEG不然PEG会漏进去;
你一直用的冷冻干燥我也想用,但是担心对蛋白的活性有影响,请问:你有在冷冻干燥前加保护剂吗,比如甘露醇什么的;你是把蛋白冻成干粉再溶解(这样会不会因为蛋白的盐浓度太高而不容易溶解啊),还是留有部分液体以浓缩液的形式保存啊(这样又有冻融的危险哦),我在可真是前怕狼后怕虎啊,呵呵
我冷冻干燥前没有加保护剂，分子量不是很大的话冷冻干燥不会有太大的影响，分子大的话可能会改变他的空间构象（听老师说的）。我的蛋白分子量大约40多kd.活性还好没丢。不过我发现，如果冻成干粉再用buffer溶的话，在做page的时候，蛋白跑不动，这是我正愁的问题！而我没冻干留有少量的液体时，做page不错。我不知道为什么跑不动连溴芬兰都不跑！郁闷呢！是不是盐的问题？大家帮我想想阿！谢谢！
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redbutterfly[使用道具]
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 小中大
还有请问你说得合适分子量的peg 是什么意思啊？我不太懂，我没用过。谢谢！
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