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标题:【求助】上质谱前样品处理的疑问？

喜乐lele[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】上质谱前样品处理的疑问？


请教各位高手：
本人最近打算做质谱，但查的资料有出入：有的要求用DTT与IAA处理，有的则没用，我非常疑惑？有哪位高手能不吝赐教吗？万分感谢！
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bring[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用DTT和IAA是2D分离蛋白的时候用的，质谱是做蛋白酶解后的肽段的分离和测序用的，通常是酶解后挥干NH4HCO3，再把肽溶解在10µl 0.1%TFA里，然后用ZipTip C18除盐，最后样品在溶解在25µl0.1%TFA里。
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

ZipTip C18除盐的过程有可能丢失亲水性比较强的肽段
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喜乐lele[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人还是不懂,我说的DTT与IAA处理，就是在蛋白点被切与脱色处理后的处理.请指教.
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plaa[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

DTT是还原剂,用它水化胶样是为了还原样品.之后碘乙酰胺,是烷化剂,是为了烷基化半胱氨酸残基,也为了进一步去除DTT的影响.
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plaa[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我没有看过做maldy-tof不用DTT和IAA的.lz能把相关文章发给我吗?
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们在做的时候加DTT是为了还原，打开双硫键，加IAA甲基化，然后LC/MS测定酶切后的肽段。
做不加DTT和IAA的，得到的肽段信息会有不同，综合两者信息，可以判断二硫键的情况。
偶也是刚刚做一点。
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yes4[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主的问题，楼下的人回答没中的。
楼主问的是在酶解过程中是不是一定要做还原和烷基化。
做也可以，不做也可以。综合一起，为了节省时间，节省药品，减少在还原烷基化后重复的洗脱导致胶内蛋白的丢失，最好选择不做。Amylum兄说没见过，有机会来这里看看。
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04906[使用道具]
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发表于 2014-6-21 17:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果样品复杂，还是要做一下的好；如果样品相对较为简单，可能不做也可以，尤其是对那些水溶性好的蛋白质。
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