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标题:【求助】western blot转膜困难

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发表于 2014-6-25 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western blot转膜困难


我的目的蛋白大约37kd左右，电泳结束后转膜用的NC膜，恒流（1mA/cm2），一个半小时左右，我觉得时间上应该不是问题，可就是电转结束，将胶染色后，还是转移非常不充分，不知道究竟为什么，这样已经做过3次，都如此，最近转移都不好，心里又很着急做western。还请大家给指点下，谢谢！！
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mimili_901[使用道具]
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发表于 2014-6-25 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是新手~
有没有可能你转膜的时间有些长了？
或者，电流有些太小？
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发表于 2014-6-25 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

嗯，你说的 也是，我知道 时间 是长了些 ，但结果却是并没有转的很彻底，而且 一般 电流 所用的 也就 0.8-3mA/cM2,想必这也是常规吧 。
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发表于 2014-6-25 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
得看你用的是什么牌子的电转仪
我用的是伯乐半干电转仪
恒压15V 1.5小时
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-6-25 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知道你用什么方法转的膜，是半干还是全湿？ 我用的是0.22um的NC膜，北京六一厂的电转仪，全湿法，横流 90mA 两个小时，经过验证，只有极少部分大分子量的蛋白没转过去。我感觉你要的目的蛋白不是很大，小分子量的蛋白是较容易转膜的，你可以先用丽春红染一下膜，如果你要的目的蛋白转过去了，你可以做WB。想转膜充分就延长转膜时间或提高电流试试。
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发表于 2014-6-25 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的目的蛋白大约37kd左右，电泳结束后转膜用的NC膜，恒流（1mA/cm2），一个半小时左右，我觉得时间上应该不是问题，可就是电转结束，将胶染色后，还是转移非常不充分，不知道究竟为什么，这样已经做过3次，都如此，最近转移都不好，心里又很着急做western。还请大家给指点下，谢谢！！

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37KD,就和GAPDH一样大啊，我的蛋白是53KD，也使用的NC膜，湿转法，100v电压1小时，Bio-Bad，在同一张膜上做GAPDH和目的蛋白，都很清楚。建议你尝试湿转恒压法 100V 50分钟 一定没问题
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-6-25 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我感觉是电流太小了。
我们用的是100mA，通电5小时，Bio-Bad
效果还不错
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-6-25 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用100mA，一般5小时够了，不然你先转过夜试试，效果一定很好
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H2O[使用道具]
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发表于 2014-6-25 18:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我感觉是电流太小了。
我们用的是100mA，通电5小时，Bio-Bad
效果还不错

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湿转吗？多大的胶 ？电流似乎还可以，时间 似乎太长了吧？
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