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标题:【求助】PMF数据比对

changlhsyo[使用道具]
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发表于 2014-6-25 18:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PMF数据比对


做了好几个酶解，峰都挺多，mascot和expacy都用过了，就是找不到合适的蛋白。请高人指点。图谱如下。先谢了。


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2014-6-25 18:12
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-6-25 18:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1。种属是什么？有蛋白质库吗？对于可能的新蛋白，就算有比较好的图也可能匹配不到好的结果。
2。从你图标的数值可以看出，你的MS的分辨率不是很好。只精确到了0.01Da。可能让你的鉴定的置性度降低。
3。你扫描的分子量范围起点高了吧。根据基质的特性，建议从700开始。
4。从你图上可以看出，你的高质量肽比较多。所以你在选择漏切位点的时候，可以将数值设置大点。或者你在酶解的时候，充分点。
5。从图可能推断1994.78是常见的角蛋白污染峰，如果是这里可以得出以下结论：这个峰理论值是1993.9772,以此说明你的MS不精确，需要校正。另外你在酶解或者其他的过程中有污染，你可以将这些峰滤掉。
最重要的是，仅仅通过MS鉴定蛋白的可信度很低，现在发文章需要MS/MS。
如果可能的话，复旦有ABI的4700（MALDI-TOF-TOF），可以帮你解决你的问题。
电话：021－54237416
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daod[使用道具]
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发表于 2014-6-25 18:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的峰值都很低啊,我们做的PMF最低峰值也比你这大.峰的多少由标记参数来决定.这有很多的个人经验和习惯在内，并不能代表你酶切质谱质量的好坏.你质谱图显示信号与背景值太相近,你质谱鉴定的可信度不高哦?!
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发表于 2014-6-25 18:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得1994.78不是角蛋白峰,常见的是1993.95和1994.10
不过,你这个图的范围确实有点问题,至少应该从1000开始,
再看你的图中好象没有看到酶的自切峰,这样不好判断精确度,
看图感觉,用的激光有点强,都漏空了,所以不准,最后就是累加不够.
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发表于 2014-6-25 18:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

同意楼上的观点，不过显示的小数点位数是可以选择的，分子量范围也许是楼主自己把图谱Zoom的， 从800－4000是通常的选择，做的人不可能不知道的啊。但是我认为鉴定蛋白，还是要用LC-MS/MS, Maldi更适合用来比较差异，和验证。比如你鉴定了两个不同的蛋白（结果会显示和数据库吻合的肽段），把他们再用MALDI打一下，看看是不是能找到数据库显示不同的肽段。
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-6-25 18:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
""但是我认为鉴定蛋白，还是要用LC-MS/MS, Maldi更适合用来比较差异，和验证。比如你鉴定了两个不同的蛋白（结果会显示和数据库吻合的肽段），把他们再用MALDI打一下，看看是不是能找到数据库显示不同的肽段。""
楼上应该知道除了MALDI-TOF还有MALDI-TOF/T0F，MALDI-QIT-TOF吧，如果走2DE的点，难道也用LC-MS/MS？楼上低估了MALDI高通量的作用。
楼上说的鉴定了两个不同的蛋白，指的是用ESI还是MALDI?如果是ESI鉴定了两个不同的蛋白，还有必要用MALDI来验证吗？如果楼上用2DE的点走LC-MS/MS,再拿部分样品用MALDI来验证，还不如直接用MALDI来做，除非你只有MALDI-TOF.
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changlhsyo[使用道具]
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发表于 2014-6-25 18:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的指教，我们就是只有MALDI-ToF,就是ESI鉴定了小鼠脑子两个不同处理情况下得到的不同的蛋白，要用LC-Ms/MS 结合来看，说明在一种情况下有这个肽，另一种情况下没有，当然最好还有用MALDI来验证，这样更有说服力，。我没有用2D, 我是用HPLC来分离蛋白的。
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changlhsyo[使用道具]
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发表于 2014-6-25 18:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那请问用maldi-tof ms/ms打出来的pmf,pst图谱搜索出来的结果还需要进一步用其他方法(比如RTPCR,免疫之类)验证吗?
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