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标题:【求助】帮我看下2D胶

zhezhe[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】帮我看下2D胶


前两天跑的胶，让自己都大跌眼镜，怎么能跑成这样呢？虚心向同行请教
碱性区域的竖条纹是怎么回事？
中间有段没有蛋白，是不是因为泡胀不均匀所致？如何控制胶条放入的手法，使得胶条可以均匀泡胀？
平衡液我加的是2.5ml每根胶条，10分钟，是不是太少了？因为有看到过平衡不充分会导致横纹增加


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2014-6-26 17:09
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你泡涨的时候，在泡胀托盘泡胀槽的一侧均匀加入上样液，撕开IPG干胶条的保护膜，胶面向下均匀覆盖上样液，尽量勿产生气泡。关于平衡液你的方法确实有问题，我通常都是用5ml的平衡液平衡十五分钟的，平衡不充分的话肯定就会产生条纹的。
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我画了2张图，按照你的意思应该是按照右边的示意图上胶条吧？
你还能解释下碱性区域横贯全图的竖条纹吗？
我二相是恒压300V跑的，3个半小时跑完，是不是太快了？


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jujuba[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

碱性区域横贯全图的竖条纹是核酸。建议你在处理样品的时候用超声波探头对样品进行半小时的超声（样品置于冰上，频率1万~2万赫兹，超声：间隔时间比为1：9），该步骤可打断大部分DNA和RNA，然后高速离心去沉淀。
平衡液确实太少，一般每步用5ml的平衡液平衡15min。
第二向应该稳流而不是恒压，一般为每板胶20mA，跑完需要8-10小时。
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
核酸是酸性物质，怎么会出现在碱性区域呢？还请楼上战友进一步解释下，^_^。
在BIO-RAD的操作手册上确实有恒压跑胶的说明，还请楼上解释下为什么不能恒压呢？
关于平衡的时间和用量，我也觉得是太少了
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moonlight45[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是使用伯乐系统，恒压200V，6.5小时左右跑完，循环水浴15摄氏度，你的是不是太快了？你碱性区的竖条纹及蛋白空白区域应该是蛋白水化不均匀所致，核酸是应该在酸性端的。你画的图我没看明白，总之是使水化液均匀铺满IPG胶条面就可以，不要产生气泡。
另外平衡液建议使用5 ml，15 min，你的是少了点。
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 小中大

我画的图是我上胶条的一个具体手法，底部为泡胀槽，上面为胶条。
我采取的是左边的方式，感觉这样上胶条容易挤压胶下的水化上样缓冲液，使得缓冲液在胶下分布不均匀。
右图是我理解的2楼战友的意思，先把缓冲液加在槽内的一侧，然后夹住胶条两端，使胶条平铺在缓冲液上。我觉得应该采取这种方式。
还请各位战友讨论，谢谢
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发表于 2014-6-26 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主：
我也出现了同样的情况，即中间没有蛋白，但我也是用了5ml的平衡液，作用了15min。
我现在也不知道哪里出现了问题，但是我觉得应该是聚焦没有完全，因为就算你泡胀时不均匀，根据等电聚焦的特性，任何位置的蛋白都可以到达其合适的位置(PI)，所以，我们是否该从等电聚焦上找一下原因。
另外，楼主你现在怎么样了？改进方法后结果有改观吗？请回，谢谢
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

泡胀不均匀的示意图，如果泡胀成这个样子了，“根据等电聚焦的特性，任何位置的蛋白都可以到达其合适的位置(PI)”这句话还成立吗？


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whitesheep[使用道具]
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 小中大

我也认为是聚焦时间不够所致，这样蛋白点不能完全跑开
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