【求助】2D血浆去白蛋白和IgG后电泳图失误

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标题:【求助】2D血浆去白蛋白和IgG后电泳图失误

babybabe[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

血浆用主料处理后，样品超滤后电泳结果，请帮忙分析失误原因。万分感谢

附件

2014-6-26 17:18

54884332.snap.jpg (19.02 KB)

plaa[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

从图谱看的话,在你处理样品很好的前提条件下,分子量较大的蛋白质跑的分离是较理想的, 具体的条件你又没说清楚 .不过我建议你跑下狭窄胶条较好 ,至少从你的图谱上是这样分布集中的拉.
图谱上有纵条纹说明你在平衡时没优化好平衡的条件 ,还原化和烷基化不过 ,我建议你在平衡时做个比较把条件优化下.
我认为你做实验的时候注意下操作拉.

babybabe[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢建议，
具体试验条件是这样的：
上样量120ug，24cm胶条，PH3-10，SDS—PAGE为12.5%。
等点聚焦：30v 12h；500v,1h;1000v,1h;8000v,gra,1h;8000v,85000vh;8000v,1h。水化液中处理前样品DTT50mM，处理后样品DTT25mM；平衡15ml/次，各20分钟，1%DTT及2.5%碘乙酰胺。
电泳40mA 50分钟，85mA 4：30h，
银染
样品过BLUE及ProteinA柱料后以3000分子量的超滤管浓缩并脱盐，置换入水化液。
可以仔细讲一下操作的问题可能出在哪里吗谢谢

xue258[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

“血浆用主料处理后，样品超滤后电泳结果”‘，没看懂你的样品处理方式。
问题有两个：1电泳结果就是蛋白较少。主要是平衡时间太长，每次不要超过15min。
2 蛋白斑点拖尾。主要原因是电泳电压太高电流太大。建议5mA/胶-1h+30mA/胶*之电泳结束。

babybabe[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢建议。
以前用平衡15分钟，总是有拖尾，疑心平衡不足后来延长时间的。好像的却改善不多。
上面的条件是2块胶一起跑得。每块胶20mA,50分钟；后40mA.至结束
我的电源好像调不到5mA,最小10mA，这样可以吗

zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

样品特点暂且不谈（出点多少），且说纵向拖尾，有两点要注意的：
1）调整1.5M Tris-HCl 的pH至8.8。（放久了会升高）
2）控制二向电泳电压或电流。时间允许的话，让它跑的稍微慢点试试

jkobn[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢建议。
以前用平衡15分钟，总是有拖尾，疑心平衡不足后来延长时间的。好像的却改善不多。
上面的条件是2块胶一起跑得。每块胶20mA,50分钟；后40mA.至结束
我的电源好像调不到5mA,最小10mA，这样可以吗
......

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拖尾也可能是电流大造成的。如果你的电源能调功率也可以。1w/胶*1h。~5w/胶

tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

样品过BLUE及ProteinA柱料后以3000分子量的超滤管浓缩并脱盐，置换入水化液。
去白蛋白和IGg超滤浓缩可能会引起蛋白丢失，我们做过样品不经处理，直接上样效果也还可以。另外tris的PH（8.8）和平衡时间（15分钟以内）也很有影响。
二向时可以20mA/胶，40分钟；30mA/胶，至结束。
再有就是你的操作手法应该更严谨点。