【求助】请教蛋白浓缩?

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标题:【求助】请教蛋白浓缩?

sr9971[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我搜索本版看到的:最简单的办法就是将粉末状的PEG覆在透析袋外面，一般用PEG8000或分子量更大一些的。不断更换PEG会加快浓缩速度。
我提纯的蛋白分子量为150~160KD,透析袋截留分子量为10000~12000.
那我是不是该选PEG20000?
具体怎么操作?粉末状的PEG覆盖多久?直接用水冲去?反复几次?最后透析袋中的会变成固体?如何取出? 我提的蛋白要用于细胞培养,不知用PEG是否有影响．
另外有介绍millipore的超滤离心管.除离心管,还需什么特殊装置吗?
对不起，问题太多Tongue

hold住[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

推荐你用20000。把你的蛋白装入透析袋，扎好，如果有条件，可以使用专门的夹子；然后用固体的PEG覆盖就可以。中间注意一下透析袋中样品的体积，如果体积已经满足要求，随时可以取出透析袋。样品可直接用移液器取出。在PEG浓缩的过程中，可能会发生PEG对蛋白的修饰，至于对以后的实验又没有影响，就要单独分析了。
如果使用超滤离心管，相对来说简单一些。只要有相应的离心机就可以了。新的超滤离心管的滤膜设计成了V型，效率更高，使用也更方便。
个人认为，这种情况用超滤离心管好一些。
PS，有些时候目的蛋白可能会吸附在超滤膜上，注意一下。
希望对你有帮助。

bring[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不太建议你用透西袋，毕竟分子量有些小。超滤离心管好一些，截留分子量有小的，如pull的有1000，3000的，millipore的有3000的，也不是很贵。另外这种情况冻干是不是更好一些呢，建议你试以下

sr9971[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

hold住提到：如果使用超滤离心管，相对来说简单一些。只要有相应的离心机就可以了。
我不知道相应的离心机是指什么．我现在用的低温离心机不知可不可以．是否满足转速　温度　大小即可？

sr9971[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不太建议你用透西袋，毕竟分子量有些小。超滤离心管好一些，截留分子量有小的，如pull的有1000，3000的，millipore的有3000的，也不是很贵。另外这种情况冻干是不是更好一些呢，建议你试以下

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谢谢,可惜我们没有冻干机.
我提纯的蛋白分子量为150~160KD,会很小吗?用透析袋会有什么缺点?

jujuba[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

浓缩大概有
1 超滤浓缩如果你想截住目的蛋白请用小于蛋白3倍截流量的透析带反之用大于分子量3倍的透析带！适用于大规模生产!
2 层析这几本上属于做到后期可以一举多得的方法（分子筛不行）既可以浓缩又可以纯化但最好是上至少80%以上的蛋白不然作用不大尤其是纯化！
3 透析这个方法一般用于小规模试验室级别，首先处理透析袋见分子克隆，用夹子（当然系扣子也可以，只是不能重复利用多可惜，剪的都是钱啊！）把一端系上灌入蒸馏水再用夹子夹另一头，微微用力试试漏不漏，如果不流水ok，把蛋白放入加好，在上边撒上peg20000一般20000不会进到里边了,等2000全部湿透再加（也有把peg20000配成溶液的但我没用过）直到体积浓缩到你想要的体积为止至于里边的固体？？该不是你没注意把水分吸干后又风干了吧！（1要频繁的上下颠倒透析带混匀其中的样品防止局部浓度过高的现象，2完成后把外边的peg洗干净，可以回收下次继续用，3暂时还没听说peg对蛋白有啥影响，应该还有些保护作用是真的，只是会沉淀蛋白但一般稀释后会重新溶解）。
4 像硫酸铵沉淀也很好用，是粗纯的经典方法当然如果硫酸铵分的不细可改用极性稍微若得盐也许会起到更好的效果也说不定,此法还是比较温和不会损失蛋白，且也可达到纯化的作用。
5 离心如楼上说的超滤离心管好一些，截留分子量有小的，如pull的有1000，3000的，millipore的有3000的，也不是很贵。
6 冻干一般是在最后出产品时使用因为要加保护剂如海藻糖，tween，山梨醇什么的，虽然能浓缩，且能起到杀菌之功效，但如过早使用会加入一些不必要的“杂质”似乎不妥！
最后如果你用透析袋买截流量为例蛋白1/3的透析带目的蛋白就不会跑出去，超滤其实就是把N多透析袋压在一起，可浓缩可换液也可起到粗纯的功能不妨一试！
祝好运！

nn255[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你问的关于PEG浓缩的问题除最后一个都是肯定的回答。
但是注意不要把你的样品浓缩干了，这样活性损失比较大的，而且特别少的时候最好换半径小的透析袋，因为透析袋会吸附你的蛋白质，半径大，表面积也大，吸附的自然就多，而且大的话上下两层透析袋局部容易干掉，这样就不好了。
加入干了你就放在水中透析一会，会吸水的，不用紧张的。不过活力会损失大一些。
其实硫酸铵盐析是一个不错的浓缩办法，盐析以后透析就可以了，比较实用的，不影响细胞实验的。推荐使用

sr9971[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我上面写错了
我的透析袋截留分子量为14KD加减2KD.
打算选PEG20 000浓缩.
这样的分子量会不会不安全? 造成PEG进入透析袋?

xyw5[使用道具]
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发表于 2014-6-26 17:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 sr9971 于 2014-6-26 17:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
hold住提到：如果使用超滤离心管，相对来说简单一些。只要有相应的离心机就可以了。
我不知道相应的离心机是指什么．我现在用的低温离心机不知可不可以．是否满足转速　温度　大小即可？ ...

对。如果用超滤离心管，可以先少放一点样品试一下，看看能不能达到预计的效果。我们曾经碰到过蛋白被吸附在膜上。
PEG浓缩的时候可能会存在修饰，会不会有影响就看你下面的实验做什么了。你用的透析袋我觉着问题不大，但是在这方面我经验确实不多。