蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】PVDF膜用前要用100%甲醇润湿吗

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标题:【求助】PVDF膜用前要用100%甲醇润湿吗

kulee[使用道具]
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发表于 2014-6-27 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PVDF膜用前要用100%甲醇润湿吗


刚定的PVDF膜不知道怎麽用,请大家指点指点!
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qhyu[使用道具]
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发表于 2014-6-27 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

同问，我一个以前专做wb的同学说先用甲醇泡一分钟，老板说直接泡电转液。
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发表于 2014-6-27 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

泡30秒足够了。
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-6-27 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

要用甲醇泡的，大概一分钟
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发表于 2014-6-27 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用甲醇活化不能超过15秒，时间太久会对pvdf膜造成损伤。找一个平皿，倒入一定体积的纯甲醇，用镊子夹着膜边角在纯甲醇里漂一下，见到膜由不透明变为均一的半透明，大概需要5秒左右即可。然后立即向平皿中加入不含甲醇的转膜液，使甲醇的终浓度在20％，将凝胶和膜以及滤纸在其中平衡30min左右即可转膜，在整个过程中注意不要让膜干了，如果膜干了就需要重新活化。注意操作中不要划伤膜或者弄脏膜，否则显色后会出现痕迹，干扰结果判定。膜的孔径也是值得考虑的问题，普通大中分子量蛋白可选0.45um的就可以了,但对小分子量的多肽则需要0.22um的膜。尼龙膜和NC膜不需活化。可以参照随膜附带的使用说明操作，生产PVDF膜的公司如millipore网站上就有使用说明。还可见以下网站的说明：
cuturl('www.schleicher-schuell.com/bioscience')
祝好运！！
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发表于 2014-6-27 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

活化过程
100％甲醇 1min，纯水 3min，然后浸泡于电转液中留做转膜既可
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发表于 2014-6-27 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

必须用甲醇浸泡，以增加PVDF膜的亲水性，然后用ddH2O或者PBS浸洗，在放入transfer buffer或是封闭液中。
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发表于 2014-6-27 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Millipore的蛋白质印记手册中推荐的步骤：
1、在甲醇中润湿膜15秒。膜应该均匀的由不透明变成半透明。
2、小心将膜放入 Milli-Q水中浸泡2分钟。
3、小心将膜放入转移缓冲液中平衡至少5分钟。
我最近也将作转膜，希望能和大家多交流经验。
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发表于 2014-6-27 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好象在甲醇中浸泡一下PVDF膜就可以了，时间1分钟左右，不用那么严格吧，然后放入转膜液中放几分钟即可，在这个过程中就可以对齐滤纸、膜和胶了，然后湿转或者半干转。
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2014-6-27 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Millipore的说明书上的步骤：
1、在甲醇中润湿膜15秒。膜应该均匀的由不透明变成半透明。
2、小心将膜放入 中浸泡2分钟。
3、小心将膜放入转移缓冲液中平衡至少5分钟。
老外很严谨，说得不会错
Milli-Q水可以用纯水代替
pvdf膜不亲水，如果不泡甲醇，转移液都无法浸湿，无法使用，而且使用过程中尽量不要使它干燥，否则什么都结合不上去，很可能影响结果
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