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标题:【求助】关于caspase-3 western blot

66小飞侠[使用道具]
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发表于 2014-6-27 11:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于caspase-3 western blot


各位高手，我现在正在做关于caspase-3蛋白表达，方法应用 western blot，但是显色后，出现了两条带，不知道怎么回事。想请做相关研究的高手指点一下。谢谢！
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yonger[使用道具]
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发表于 2014-6-27 11:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

caspase-3前体大概是35kD，活化时被剪切成19kD和17kD的两个小蛋白发挥作用的。所以，如果你的样本是诱导凋亡的，而且两条带大小如上，那么恭喜你，那是对的。建议好好看看说明书，应该都有说明的。
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发表于 2014-6-27 11:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
分析时两个小蛋白才是能说明凋亡情况的，所以胶浓度最好至少12%，15%比较理想
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yysr238[使用道具]
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发表于 2014-6-27 11:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的试验中也有caspase-3这个WB，你们的观点我非常赞同，但我也发现一个奇怪的现象，就是我的一种细胞能够看到19kD和17kD的两个小蛋白。令一种只能看到一个剪切片断，但流式已证明的确有凋亡，且caspase-7,8 WB显示有激活。不知为何只能看到一条剪切带。请赐教。谢谢
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发表于 2014-6-27 11:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
只做了实验，没考虑过这么多，顶一个
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-6-27 14:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我查到的资料是caspase-3 proenzyme: 31594 Da；active: p17 and p12．
我的实验中31kD很容易出来,17kD就是在凋亡明显的细胞中能出来,11kD的则没有出来过.
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发表于 2014-6-27 14:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 fsdd817 于 2014-6-27 14:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我查到的资料是caspase-3 proenzyme: 31594 Da；active: p17 and p12．
我的实验中31kD很容易出来,17kD就是在凋亡明显的细胞中能出来,11kD的则没有出来过.

我抗体说明书搞笑:分子量:17kd 19kd 35kd,而在介绍时却也说是p17和p12,而且针对的是35kd的前体和17kd的p17
我想两条带原因有二
1 12kd分子量太小容易过转
2 抗体只针对前体和p17而不针对p12表位.所以只有两条带.我cell signaling 抗体说明书如是说:detects endogenous levels of full length caspase-3(35kd) and the large fragment of caspase-3 resulting from cleavage(17kd).估计你可能是这个原因.
另外wzc7682asd 的两条带估计一个是35kd的前体,另一个也是p17而不是p12.
jxz19771218 所说的19和17kd是不是确实就是19和17kd,还是35和17kd?我想19和17kd即使用15%的胶分的都不一定很开,还请明确一下.如果总共是两条带而且之间分子量相差尚多,那么肯定是35和17kd,那么就很好解释了,可能是激活量的不同.如果不是,那么肯定是3条带(35kd肯定会有),那就不知其因了
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-6-27 14:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的抗体大概和YAPLEWANG的一样，货号9662，CST的，说明书中也是提到分子量:17kd 19kd 35kd，:detects endogenous levels of full length caspase-3(35kd) and the large fragment of caspase-3 resulting from cleavage(17kd).我的一种细胞能够侦查到三条带，一个是35的酶原带，然后在靠近20KD的附近有两条cleavage fragement ,该两条距离很近，相距0.2厘米左右。另一种细胞只看到35的酶原带和一条cleavage fragement ，这条是17还是19 我也不能下结论。根据抗体说明书的附图，jurkat细胞和NIH3T3的cleaved fragement 还是不一样的，所以我觉得有可能和细胞种类也有关。YAPLEWANG可以看下自己的阿抗体说明书，再讨论。
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yonger[使用道具]
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发表于 2014-6-27 14:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 duoduo 于 2014-6-27 14:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我的抗体大概和YAPLEWANG的一样，货号9662，CST的，说明书中也是提到分子量:17kd 19kd 35kd，:detects endogenous levels of full length caspase-3(35kd) and the large fragment of caspase-3 resulting from cleavage(17 ...

我今天下午再到实验室对一下说明书，核对一下。
你能不能把你western的结果贴出来看一看，这样才可以分析，并能够找到相应的原因。我想靠描述可能词不达意。
我下午回来改帖。希望能看到你的图，并给于相应的解释。^_^
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-6-27 14:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不好意思，我的试验结果涉及到发文章，不能随便出示。
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