【求助】关于caspase-3 western blot - 经验共享

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标题:【求助】关于caspase-3 western blot

yonger[使用道具]
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发表于 2014-6-27 14:53 资料个人空间短消息加为好友

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QUOTE:

原帖由 duoduo 于 2014-6-27 14:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不好意思，我的试验结果涉及到发文章，不能随便出示。

那你就把出来的3条带的和2条带的用photoshop各剪出一条带看看，这样就不牵涉你的机密了，而且顺便也可展示一下你的wetern结果，我根据你的条带然后对比说明书上的标准图然后给予我的观点，最好说明你的组织和源性并把marker也附上，这样也便于判断分子量。
我的货号和你一样，这就是说明书的网址cuturl('http://www.cellsignal.com/product.asp?catalog%5Fname=CellSignal&category%5Fname=&product%5Fid=9662')
下面的第一张图是我拷贝说明书上的，以便其他战友也可以看到。如果你不愿贴图也无所谓，我在这里就把可能的原因先分析了
请仔细看图一这段话（货号9662）：Source/Purification: Polyclonal antibodies are produced by immunizing rabbits with a synthetic peptide (KLH-coupled) corresponding to residues surrounding the cleavage site and the amino-terminus of the large fragment of human caspase-3 Antibodies are purified by protein A and peptide affinity chromatography.
这段话有这么几个关键点：1 多克隆； 2 表位针对剪切点周围以及大亚基氨基端；3 经过纯化。图上显示前体为～31kd，大亚基为～17kd，jurkat T细胞17kd上下似乎是有加减2kd的条带存在。所以抗体只针对p17和前体而不针对p12。因为没用小亚基表位刺激，所以小亚基不应该出现条带。
再看第二章图（CST另一型号抗体，货号9661）上的这一段：Specificity/Sensitivity: Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody detects endogenous levels of the large fragment (17/19 kDa) of activated caspase-3 resulting from cleavage adjacent to (Asp175). This antibody does not recognize full length caspase-3 or other cleaved caspases.意即在Asp175周围减切后可能产生两个大亚基：17/19 kDa，而不针对小亚基。我想sun082000 是对的。小亚基是p12。对于你检测的3条带（使用图一的9662抗体）其中一条是前体，一条是大亚基p19，另一条是大亚基p17，没有p12。你只有2条带的一条是前体，一条是p17。对于sun082000 的情况我想用这一点就很好解释了。你所说的“细胞种类"导致的差异从图二中可以明显看出来，图二还说明了不同细胞对同一种激活物反应不同，而且同一细胞对不同激活物也会导致不同的减切方式。这个现在是可以肯定的了。
因而图一p17的上面一条弱带是p19，下面一条我无能力分析（分子量>12kd，不是p12，可能是其他杂带，从图二前体图也可以看出来纯化后的抗体还是有非特异条带的）。实际p19是不应该出现的，而其出现的原因可能是针对剪切点周围的并且没有通过纯化去除的微量抗体引起的。因为我们使用的抗体可能纯化的不完全，残留部分p19抗体，所以如果蛋白中p19量高一些的时候还是会被检测出来的，但一定远远弱于p17。
我对前几帖的认识错误表示纠正。
分析如有疏漏还望指正。
图一（图二见下一帖）

附件

2014-6-27 14:53

70636096.jpg (64.94 KB)

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发表于 2014-6-27 15:07 资料个人空间短消息加为好友

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图二（货号9661）

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