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标题:【求助】心肌细胞裂解的详细过程

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发表于 2014-6-27 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】心肌细胞裂解的详细过程

准备做心肌细胞的western-blot,想请教心肌细胞裂解的详细过程。小妹在这儿有礼了！Smile
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发表于 2014-6-27 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

嘿嘿,你真幸运,心肌细胞是所有组织中纯度和最不容易降解的细胞之一。意即你的细胞裂解会相当成功。用分子克隆上的就行。
附件里是我的操作，参照分子克隆第二版，送你看看
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发表于 2014-6-27 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

仁兄啊，小妹忘记说了，我做的是细胞，不是组织。不过还是要谢谢你。
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发表于 2014-6-27 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哈哈,细胞那就更简单了,如果不提核蛋白连超声都不需要.
还以RIPA裂解液为例
蛋白质的抽提(培养细胞)
1.对于贴壁细胞:弃去培养基, 冰上于培养瓶加预冷PBS 1ml，细胞刮子刮取培养瓶中细胞(若为悬浮细胞则直接从2开始)
2. 吸入1.5mlEP管，
3. 在4℃条件下，800g离心5分钟，小心弃去上清。
4.按照1：5（重量/体积）加裂解液，漩涡振荡10秒使沉淀物再悬，
5 (如提取细胞总蛋白需此操作,对于胞浆蛋白则不需,直接进入6) 冰上静置5分钟。冰上超声150w 5秒，间隔15秒，共2~3次。
6 冰上静置10~20min。在4℃条件下，15000g离心15分。
7. 转移上清液于EP管中，吸取1ul用于蛋白浓度测定，其余分装存于-80度。
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发表于 2014-6-27 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好的，谢谢师兄！只是有一点小妹还是不明白，即“按照1：5（重量/体积）加裂解液”，细胞重量怎么得知啊，是不是要称一下？呵呵，别怪小妹事多！
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发表于 2014-6-27 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般不要称重的.1：5（重量/体积)只是一个推荐量,实际上并不是完全严格要求.细胞量超级超量(比如细胞体积大于裂解液体积的1/2)时可能提取效率不高和因蛋白酶抑制剂量不足而降解蛋白.一般是根据蛋白浓度调整裂解液的量,蛋白浓度2~10ug/ul都可以,对于培养细胞一般5ul/ul就不错了,组织最好在10ul/ul左右.
根据我的经验一般一瓶细胞(25平方厘米培养瓶~5,000,000细胞),离心后大概一个熟米饭粒大小,加200ul裂解液,获得蛋白浓度就在5ug/ul左右.因为不同组织蛋白丰富程度和细胞韧度不同,所以蛋白收获量会稍微有些差别.你心肌细胞是原代培养,是韧性比较高的细胞,所以可能收获率会稍微低一点点吧.
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发表于 2014-6-27 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好的，这个问题我明白了。
还有一个问题，就是我测的是心肌细胞的总ERK1/2和磷酸化ERK1/2，书上讲ERK1/2磷酸化激活后由胞质转位到核内，作用于转录因子，那是不是就意味着要进行第5步即“(如提取细胞总蛋白需此操作,对于胞浆蛋白则不需,直接进入6) 冰上静置5分钟。冰上超声150w 5秒”，而我们实验室只有低温离心机，没有超声，是不是还不行啊。不知还有没有别的办法？
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发表于 2014-6-27 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1 如果老板有钱就去买试剂盒，如果想锻炼自己那就自己配裂解液。我记得我们实验室有老师也做总ERK1/2和磷酸化ERK1/2，用的是大鼠缺血再灌注模型取海马区。他好象只提取细胞胞浆蛋白，不提取细胞总蛋白。“书上讲ERK1/2磷酸化激活后由胞质转位到核内，作用于转录因子” 我不做erk，不清楚是不是如此，请你仔细查文献确定公认的是提总蛋白还是胞浆蛋白还是核蛋白。我只知道mapk另一成员JNK是通过磷酸化c-jun组成ap-1而起作用，做的是胞浆蛋白。ERK也是激酶，不是转录因子，而且其激活下游因子究竟是在胞浆还是胞核我不清楚。请你查文章确认吧，书是参考，不能作为实验的根本依据。
2 尤其提醒：磷酸化检测时裂解液一定要加磷酸酶抑制剂（好象是钒酸钠），你自己在网上搜一下吧
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发表于 2014-6-27 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用PET-30a载体中表达蛋白基本上都在超声沉淀中,8M尿素不能溶,还怎样处理呢
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