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标题:【求助】如何从SDS-PAGE胶中提取蛋白质

njkph[使用道具]
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【求助】如何从SDS-PAGE胶中提取蛋白质


本人最近在做蛋白纯化,请教各位如何从SDS-PAGE胶中提取蛋白质。曾看到有帖说可以捣碎凝胶,加缓冲液提取。能否请问一下哪位高手具体方法如何。很急!!!多谢!!!
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wu11998866[使用道具]
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可以用电洗脱至透析袋的方法。
1 透析袋先用蒸馏水煮沸30min。
2 将你要的蛋白条带切下来,然后切成小块,装入透析袋中。将染色的蛋白条带也放入透析袋中。透析袋中加入适量的缓冲液,透析液不宜过多,刚好使凝胶切片始终保持与缓冲液接触就可以了。
3 透析袋两端用透析袋夹夹紧,避免存留气泡。
4 把透析袋浸泡在盛有一浅层缓冲液的水平电泳槽中,用玻璃棒防止透析袋漂浮,40mA电流持续45~60min,直至染色的条带完全退色为止。
5 倒转电泳的电极再电泳1min,使蛋白从透析袋上释放出来,然后停止电泳。
6 然后将透析袋中的缓冲液洗出来,一般浓度比较小,可以进行冷冻干燥浓缩。
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wood533[使用道具]
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问一个比较外行的问题,是不是这样纯化的蛋白量比较少啊?再有冷冻干燥浓缩会不会是蛋白变性啊?
小弟最近才开始接触蛋白的这些实验,还有好多不是很明白的,希望能被指点,谢谢了!
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我们实验室的方法,切下蛋白相对应PAGE胶,切碎,液氮中研磨至粉末状,加入8M尿素溶解后离心,回收效率很高的,只是回收的都是变性蛋白。
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wu11998866[使用道具]
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我们实验室的电洗脱至透析袋的方法回收效率不高,都是变性蛋白。但是看你纯化蛋白的用途是什么了,这种纯化方法得到的蛋白可以用来免疫动物制备抗体。
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头痛
我最近也一直在做SDS-PAGE,下一步也要免疫动物制备抗体,正在头疼怎样才能快速的得到比较纯的蛋白?
从SDS-PAGE中回收的是变性蛋白,能直接用于免疫动物制备抗体吗?要不要经过处理一下呢?免疫实验对蛋白都要那些要求啊?
请战友们指点一下谢:)
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我们实验室的方法,切下蛋白相对应PAGE胶,切碎,液氮中研磨至粉末状,加入8M尿素溶解后离心,回收效率很高的,只是回收的都是变性蛋白。
我们实验室里没有液氮,冰块可以么? 加入尿素的作用是什么呢?
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wu11998866[使用道具]
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从SDS-PAGE中回收的蛋白可以直接用于免疫动物制备抗体,与福氏完全佐剂混合免疫动物即可。但是这样制备出来的抗体是多克隆抗血清,这就要看你对抗体的要求了。
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INK[使用道具]
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多谢指教!我还有两个问题:
1、我现在准备做单克隆抗体,从SDS-PAGE中回收的以单一条带蛋白(已变性)与层析柱纯化后(条带也很单一,有活性)的蛋白相比较,有什么不同呢?
2、我从文献上看到,免疫动物制备抗体时,用兔子实验时得到的是多抗,而用bable老鼠则得到单抗,这是为什么呢?是不是与动物种类有关啊,要是的话,还有哪些可以用来制备单抗呢?
我原来理解,制备的抗体是由蛋白的纯度决定的,含蛋白种类越多(有杂带) 则得到多抗,蛋白纯度高(条带单一)得到的就为单抗.现在有点晕了~~~~~~:)
初涉这方面的实验,很多都不太理解,还请前辈们多多指教!
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nvdabing[使用道具]
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1.我回答一下上面的问题。抗体和你的蛋白抗原结合是与其上抗原表位结合。如果是线性表位还好。两种蛋白都有。如果是构象表位。变形蛋白中是不存在的。
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