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标题:【求助】如何从SDS-PAGE胶中提取蛋白质

nvdabing[使用道具]
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发表于 2014-6-27 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
腹水多发性骨髓瘤
2。单克隆抗体是针对单一抗原表位的，一般由腹水或者融合的杂交瘤上清获得。多克隆抗体一般由以成功免疫的动物的血清获得。兔子由于没有腹水，而且没有可以用于融合的骨髓瘤（这个骨髓瘤是我们公司的专利）。所以一般兔子抗体都是由血清获得的多抗。
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发表于 2014-6-27 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼上的，如果我要从SDS-PAGE上回收蛋白的话，是考染后（经染色脱色，可能要好几天）回收好呢，还是怎么办？（听说有一种用KCL染的方法阿）
还有就是用电泳回收的效率太低，免疫兔子需要1mg/Kg，得跑大概多少胶
我的目的是回收蛋白亚基制成抗体，望指点
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发表于 2014-6-27 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
多发性骨髓瘤

我要表达的是从啤酒中提取的一种约40kDA的蛋白,其表位是线性的还是构像的我不清楚，没有查到，可能要用层析柱纯化蛋白比较放心！
多谢yager2500 兄不吝赐教，我现在正在用层析柱纯化蛋白，然后再用bable mice 免疫制备抗体：将蛋白注入老鼠体内，后将其脾脏取出与骨髓瘤融合，再screening and cloning repeatedly，后再将杂交瘤注入老鼠体内，制备腹水，最后再从腹水中纯化单抗抗体。
我实验最终要的就是一定量的这种单抗，以可以用来检测beer中的40kDa蛋白！
想请问一下，我这种想法能实现吗？中间有有问题的地方吗？
有没有比较快少花时间的其他方法呢？
可以帮我分析一下吗？
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发表于 2014-6-27 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
腹水
你的想法听来应该没问题.
只是你是天然蛋白注射免疫的.可能其上存在不止一个表位.所以可能融合后会产生针对不同表位的好几种抗体.
我觉得你最好先在杂交瘤融合稳定以后先挑出有阳性的单克隆.然后将这些杂交瘤全部冻存.只取一株进行腹水生产.然后检测.能检测到最好.你就算达到实验目的.检测不到再换别的.小鼠应该不会太贵吧.
有机染料（丽春红、酰胺黑、坚牢绿、考马斯亮蓝），荧光染料（荧光胺、香豆素）和胶体微粒（金、银、铜、铁或印度黑墨汁）。这些染料可分为可逆和不可逆染料。通常不可逆染料的灵敏度最佳，但它干扰或无法对蛋白进行进一步分析。不可逆染料的实例有酰胺黑和考马斯亮蓝。可逆染料尽管灵敏度较低，但它允许评估胶后从胶上将其洗除。最常用的可逆蛋白染料是立春红。如果靶蛋白丰度太低，则无法用染色法检测到，但对于较高丰度蛋白，染色法通常可以体现蛋白的转移情况。
这是我看到的粗略的资料.你要尽量挑一种染色灵敏度高一点.然后不影响你后续操作的可逆燃料.我们由于不需要后续操作.都是用考马斯亮蓝.你要再仔细挑选.我有时间也会看的.只是现在工作了.晚上才能看看.
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发表于 2014-6-27 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

cuturl('http://www.ebiotrade.com/newsf/2003-10/B20031031163317.htm')
这里面介绍了一些回收蛋白的试剂盒.我们公司里要用一般都是试剂盒.你们的经费上如果允许也可以考虑.
<<一种利用普通垂直电泳槽回收PAGE胶蛋白条带的简便方法>>.这是一篇文献.你也可以查来看看.
免疫兔子前前后后可能最少要15mg吧．SDS-PAGE的回收大概就是２０％的效率．这样你就需要多一些蛋白．最好你能过量加下去．保证回收到需要的量．
另．你准备一条走天然蛋白，一条走变性蛋白么？这样也好．抗体的具体信息到时候可以比对．表位作图之后说不定还能得到抗原上的表位信息．
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发表于 2014-6-27 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
但文献上记载，一个蛋白上的几条亚基的免疫原性可能相同，用其中一条亚基免疫兔子，怕的是得到的抗体与其他几条亚基也能免疫上，这样就不能从细胞中免疫定位上了，看看有没有其他的方法阿
还有考马斯亮蓝和SDS对蛋白亚基的免疫原性没有影响吗？这样蛋白亚基的构象不就改变了吗？是不是需要除去 考马斯亮蓝和SDS才能用来免疫兔子呢？
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njkph[使用道具]
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发表于 2014-6-27 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你说的不同亚基的问题。我想了想是不是可以这样理解。如果是整个蛋白免疫。那么得到的抗体中肯定有一部分线性或者构象表位是由几个亚基之间联结的部分构成。现在既然已经是亚基了。那么制备出的抗体。应该没有问题。就是针对亚基内部的构象或者线性。那么你再用于检测的时候应该就是单一检测到那个亚基。或者带有那个亚基的整个蛋白。不会识别其他亚基。
考马斯亮蓝和SDS当然对蛋白质亚基的免疫原性有影响。SDS会让蛋白质变形的。如果你要制备针对现行表位的抗体没关系。但是要针对天然构象表位的，那肯定不行。除掉SDS后蛋白也不一定就能正确折叠复性的。这很难说。最好开始就不要接触到这些东西。可以选择丽春红一类的可逆燃料。电泳分离用非变性胶。
也不知道我说的又没有问题。有没有高人指正或者肯定一下呢？
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