【求助】为什么我的WESTERN BLOT 结果象电泳一样？

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】为什么我的WESTERN BLOT 结果象电泳一样？

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】为什么我的WESTERN BLOT 结果象电泳一样？

seven7[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72963
精华 2
积分 347
帖子 266
信誉分 104
可用分 2211
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态离线

发表于 2014-6-27 16:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PAGE 40ug 上样，NC膜转效果挺好，5％牛奶封闭RT 1h，一抗1比1千，二抗1比5千，都在3％BSA 中，ECL现色，结果根电泳是的，实在想不出和以前做的过程有什么不同，但结果就突然成了这样，真是郁闷。。。
高手指教啊，不胜感激！

duoduo[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 74511
精华 0
积分 705
帖子 1009
信誉分 100
可用分 5926
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态离线

发表于 2014-6-27 16:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

像电泳一样???
是指非特异性带多?抗体原因,抗体特异性差的话经常出现这种问题
二抗反应时间长吗?过长可以缩短.
也可以用敏感度较低的试剂,不用ECL

seven7[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72963
精华 2
积分 347
帖子 266
信誉分 104
可用分 2211
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态离线

发表于 2014-6-27 16:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非特异条带多，而且膜的边框背景都是黑的，有的地方有反带，
若说抗体特异性或二抗反应时间或ECL造成的敏感性和特异性的改变，但以前也用同样的条件，效果还好，整个过程也没有想到操作的失误，而和以前有明显不同的地方是检测的样本种属变了（由鼠改为猪的），但不好说是这个的原因，因为从整个背景的异常感觉是系统的原因，若是这样的话，一个最大的可能是抗体加多了，但我又清楚记得没有加错，最后感觉抗体在-20度会突变？或是上层和底层的浓度不同，这也太离奇了，困惑!
不知大家还有谁遇到过类似现象的，即一个抗体使用好好的，突然背景大增，象跑胶一样的？

remenb[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 75236
精华 0
积分 631
帖子 941
信誉分 100
可用分 5531
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

发表于 2014-6-27 16:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不会一抗还是原来的吧？也就是说还是抗鼠的抗体？
既然样本换成猪了，抗体当然要换

seven7[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72963
精华 2
积分 347
帖子 266
信誉分 104
可用分 2211
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态离线

发表于 2014-6-27 16:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的抗体是兔源性的针对原核表达的人的蛋白，用来杂鼠组织和人细胞结果都可以，这个蛋白有一定的保守性，虽然不知道猪的该蛋白和人，鼠同源性有多高，但后两者可用，若换的话，重新提纯猪的蛋白再免疫拿抗体就和实验的初目的走远了。

jkobn[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75366
精华 0
积分 468
帖子 574
信誉分 101
可用分 3711
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-22
状态离线