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标题:【求助】Western Blotting 突然得不到任何条带了

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发表于 2014-6-27 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】Western Blotting 突然得不到任何条带了


本人在用Western Blotting 测目标蛋白的表达，本来一直进行得很好的，得出的条带很清楚，可本周一用同样的样本，同样的条件去重复实验时，洗出来的片子干干净净，一个斑点都没有。开始 还以为是一抗出了问题，赶紧新配一抗，重新过夜摇晃，连二抗都换了，还是一点东西都没有。我在测两种不同蛋白的表达，都一点东西没有，看来就不应该是哪个特异性抗体出了问题，而是实验的环节有了问题。我用的ECL试剂别人也在用，能得到满意的结果，自动冲片机是几个实验室共用的，没听人家说过有问题，而且我把膜染色了，可以看到膜上的条带，那说明蛋白还是transfer到了膜上，可为什么就突然测不到了呢？片子上干干净净，说明根本没有抗原抗体结合物被检测到。实在想不出什么可能性了，请大家帮分析一下，多谢！
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发表于 2014-6-27 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

急啊急，找不到可能的原因之前，不敢再浪费样本做实验了，大家都来看看，帮分析分析吧！
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发表于 2014-6-27 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

重新配封闭液试试～～
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 小中大

跟封闭没关系吧？如果真的是没封闭好的话，应该冲出来的是黑片吧？
既然条件都一样，说明电转前没问题，ECL也没问题，那个人觉得比较可能的原因有：
1 抗体配制过程有问题，如果你们实验室也有人做相近的课题，可向他们借保证可以用的抗体再结合那张膜，包括二抗，看看是不是抗体的问题。
2 底片有曝光？
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发表于 2014-6-27 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢两位的分析。我觉得应该和抗体的关系不大，因为就在上周，用同样的抗体做出挺好的结果，不可能就在这周出现问题吧？而且是两种不同的抗体呢。也不会是底片曝光，我冲出来是白片，如果曝光的话，应该是黑片才对。当然最应该影响两种不同blot的结果的因素就是ECL试剂了，可是别人做的又没问题，所以我在怀疑自己的PBS溶液有问题？现在用的这瓶10XPBS确实是新配的，但溶液不对的话，会一点结果都出不来吗？有没有人有这方面的经验？
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发表于 2014-6-27 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

俺们一般都用TBST作为抗体缓冲液
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发表于 2014-6-27 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知道你用ECL显色后有没有用水漂洗过膜，然后再显色的，
如果有的话，建议你显色后不漂洗直接去压片试试，我前几天也这样，直接压片就出来了，而且非常亮的荧光，也没什么背景
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发表于 2014-6-27 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我ECL后就直接压片了，以前一直都还行的，就是这次不知怎么回事什么都没有了，现在还是很怀疑PBS出了问题，但又不知对不对。
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发表于 2014-6-27 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

冲片机是几个实验室共用的，没听人家说过有问题
我想
该证实一下,确实没有问题。
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发表于 2014-6-27 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
已经问过别的实验室在我之前和之后用过冲片机的人，都说没有问题。ECL试剂今天也被别人的结果证实是好的，那看来还是抗体的问题？一抗是不同的，二抗都是HRP－Conjugated anti－rabbit， 莫非是二抗出了问题？
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