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标题:【求助】bl21star中pET28a上与穿膜肽的融合表达问题！

owanaka[使用道具]
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发表于 2014-6-27 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】bl21star中pET28a上与穿膜肽的融合表达问题！

小弟近来利用改造过的pET28a在bl21star中表达一个与穿膜肽融合表达的蛋白，本来与穿膜肽融合表达的蛋白的位置上原来是EGFP，而且原来的表达也没有什么问题，换成我的蛋白后就死活都不表达，换了一些条件也无济于事，敬请各位有经验的大侠不吝赐教！甚谢甚谢！
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831226[使用道具]
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发表于 2014-6-27 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
排除了实验操作中产生的失误外，最有可能的是你所要表达的蛋白对大肠杆菌有一定的毒性。
顺便问一句，测序结果是否正确？
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owanaka[使用道具]
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发表于 2014-6-27 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

测序结果没有问题！现在重新制备了bl21star感受态，重新转化，仍旧没见表达！仍在重复中。。。在考虑换用其它的宿主菌试试！
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发表于 2014-6-27 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我现在想做一些关于穿膜肽方面的工作，你那里有这方面的资料吗》
可否共享一下～！！！
急切盼望中………………
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发表于 2014-6-27 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你表达的蛋白有多大？
还有构建的方向有没有验证！
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owanaka[使用道具]
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发表于 2014-6-27 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道你想要哪方面的资料?
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owanaka[使用道具]
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发表于 2014-6-27 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一个完整蛋白碱基序列大小为1083bp,另外一个是其中的一部分碱基序列大小为183bp;构建的方向应该没有问题，是把原来表达过EGFP的载体去掉了EGFP换成了我的蛋白，现在大蛋白已经挑了10个克隆仍然不见表达，小一些的蛋白虽然有表达，但是预计大小应该为10.8KD，但是表达出来的蛋白却在14.4KD以上，准备进一步做Western验证，郁闷中...
大侠有何见解？请不吝赐教！
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发表于 2014-6-27 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从你的表达情况看，你的载体没有问题，基因也没什么问题，宿主菌也没什么问题，表达的蛋白大小也并非是极限值，pET28a在不加诱导剂的条件下也可以表达，可以试试，再就是继续摸摸条件吧，低温、低IPTG.
我想问问，你的穿膜肽是合成的还是以其他方式得到的，还有就是能不能给我推荐一些关于穿膜肽的文献，毕竟，你是过来人了。
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owanaka[使用道具]
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发表于 2014-6-27 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知道你想要哪方面的资料？现在网络这么方便，几乎一切都是透明的！我的穿膜肽是自己合成的！
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am10[使用道具]
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发表于 2014-6-27 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那对于利用穿摸肽进行基因治疗你有什么高见>?
能不能留个比较方便的联系方式,常常联系?
好象你不常上网!
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