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鼠疫结核病
你好!我做过幽门螺杆菌,霍乱弧菌,鼠疫EV株和结核分支杆菌.基本都是采取的丙酮-TCA沉淀方法,效果都还可以,结核杆菌效果不是特别好,改进中.感觉你的步骤存在问题.咱们交流下:
方法一
1.集菌,用生理盐水洗菌(洗去培养基及碎片),洗菌3次,
2.收集沉淀,加入10倍体积预冷的丙酮-TCA(含DTT)沉淀蛋白.(一般的G-菌在加入丙酮-TCA后菌体基本都会破裂,菌体蛋白沉淀,我做的结核细胞壁特殊,丙酮-TCA破菌效果不是特别理想,我在沉淀蛋白前先对菌超声破菌,直接用去离子水即可.丙酮-TCA对于脂类,核苷,内源性小分子物质祛除效果明显.同时可以抑制蛋白酶活性,不必添加蛋白酶抑制剂.).-20冰箱,4小时.离心去上清
3.蛋白沉淀加入预冷的丙酮(含DTT),悬菌,(清洗残留的TCA).-20冰箱,1小时.离心去上清
4.干燥蛋白(我用低温真空干燥,效果很好,1小时就能得到蛋白干粉,这时获得的蛋白干粉已经很纯)
5,加入裂解液溶解蛋白(裂解液:2M硫脲,7M尿素,4%CHAPS,1-2%%DTT,0.5%-1%IPGbuffer,充分接触蛋白干粉,)4度冰箱过夜.
6.取出超声(过夜后你发现可能不是所有蛋白都溶解了,可能还有部分黄色未溶解物质,不要担心,超声助溶就可以了,同时可以通过超声破碎染色体,不用再添加DNAase了,冰浴超声,10秒间隔10秒,10次,蛋白全部溶解,呵呵)
7,高速离心,(祛除超声后的碎片)
8,取上清,分装,-70冰箱保存就OK了,记得取一点来测定蛋白浓度
使用时取出完全融化就可以了.不用再丙酮沉淀了.再沉淀的话损失很多.上样时用水化液稀释到上样体积就可以了.
方法二
你也可以收集菌体后，洗涤，加入裂解液(含蛋白酶抑制剂和DNAase)超声破碎，高速离心，离心后得到的上清液就OK了,测定蛋白浓度后就可以使用了很多人也用这种方法,但是也不要再沉淀了,沉淀会使你蛋白丢失造成测定的浓度不准的.
方法一制备的样品杂质较少,图的效果好.但是会有部分蛋白丢失,
方法二制备过程简单,蛋白丢失少,但是干扰成分较方法一多
你可以根据自己实验选择,其实有些步骤可以调整,但是原理是相通的.
祝好运!
