蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】western-blot的内参为什么都做不好？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 12  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】western-blot的内参为什么都做不好？

bhka[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114482
精华 0
积分 268
帖子 235
信誉分 100
可用分 1933
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
1

发表于 2014-6-28 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western-blot的内参为什么都做不好？


最近几天刚开始做western-blot，昨天做b-actin(43KD)，有几个样本出来阳性带，位置也对，但都非常弱，照相都照不下来（用凝胶成像系统）。今天为了验证一下总蛋白的浓度，进行了考马斯亮蓝的染色，结果都还可以。我想请教一下各位高手：难道我提取的蛋白真的浓度过低？每次电泳上样前都需要测定蛋白浓度吗？
另外，我的一抗和二抗的浓度分别是1：500和1：1250，不知道是否合适？还需要调整吗？
谢谢！
顶部
mimili_901[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73543
精华 0
积分 564
帖子 723
信誉分 102
可用分 4458
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-24
状态 离线
2

发表于 2014-6-28 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.最好是测下浓度,不测也没关系
2.你的一抗和二抗要按说明书稀释.我觉得你的二抗浓度过高,1:5000试试
顶部
bhka[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114482
精华 0
积分 268
帖子 235
信誉分 100
可用分 1933
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
3

发表于 2014-6-28 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢你的回帖。
我的一抗是中杉的产品，是进口分装的，说明书上建议做WB时稀释比例为1：100到1：1000。另外二抗的比例是实验室老师建议的。
二抗你们一般稀释多少倍？
顶部
bhka[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114482
精华 0
积分 268
帖子 235
信誉分 100
可用分 1933
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
4

发表于 2014-6-28 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外我还想请教一个问题：我是组织提取蛋白，用的蛋白提取液（200－300ul，视组织大小而定)＋5ul蛋白酶抑制剂（浓度是2mg/500ul)，我用的蛋白酶抑制剂难道过少？从而提取的蛋白量少？
谢谢不吝赐教！
顶部
summerxx[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75852
精华 0
积分 885
帖子 1388
信誉分 101
可用分 7783
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态 离线
5

发表于 2014-6-28 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的二抗是中杉的,1:5000稀释
你一抗1:300稀释,二抗1:5000试下
顶部
huifeng0516[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76210
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
6

发表于 2014-6-28 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果你用北京中衫的二抗,二抗浓度高了，
一抗的浓度可以,1:500或者1:1000都可以,
只是二抗体浓度浓度高了，你可以用1:3000 到1:10000,
另外信号比较弱,你可以ECL显光,相当灵敏, 你可以试一下
顶部
yychen[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77452
精华 0
积分 516
帖子 751
信誉分 100
可用分 4495
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
7

发表于 2014-6-28 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

除了楼上战友说的二抗问题外，我提几点：1.如果蛋白浓度没问题（我觉得你的蛋白提取没有什么问题），可以转完膜以后用丽春红染色，看一下转膜的效果如何，如果染色后条带清晰，可排除转膜的原因；2.可以考虑适当降低封闭液的浓度，有时按“分子克隆”上5％脱脂奶就是做不出来。我的内参（43KD，羊源）是在0.5％浓度上做出来的；3.还可以考虑三抗系统，即二抗采用生物素标记，三抗采用辣根酶标记，其灵敏度比二抗系统高一个数量级。我实验中用二抗做不出来的指标用三抗都做出来了。
顶部
vcve[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76131
精华 0
积分 743
帖子 1043
信誉分 101
可用分 6126
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
8

发表于 2014-6-28 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你提的是哪的组织，你可以试试GAPDH
顶部
shenkunjie[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76942
精华 0
积分 712
帖子 1124
信誉分 100
可用分 6420
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-11
状态 离线
9

发表于 2014-6-28 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的二抗是中杉的，效价是1：3000。你可以试试。还有内参很容易出来的，是不是你的蛋白样品出现了问题啊。楼上的排除法很好的，谢谢。
顶部
04906[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73544
精华 0
积分 599
帖子 858
信誉分 100
可用分 5155
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-24
状态 离线
10

发表于 2014-6-28 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其实，中杉代理Santa的B-actin并不好用，但是它代理国内一家医院自产的actin很好用的，大概100ul不到500RMB，我们实验室基本都改用国产的了！
顶部
 12  1/2 12››