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标题:【求助】NI柱子纯化后的蛋白保存方法

uuooii[使用道具]
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发表于 2014-6-28 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】NI柱子纯化后的蛋白保存方法


我用的是novagen公司的 NI柱子，最后洗脱用的是高浓度的咪唑（1M）进行的，我打算用这些纯化的蛋白免疫小鼠作单抗，能行不?要先透析去咪唑再免小鼠吗？由于纯化的量较小，透析肯定有损失。不透析怎么保存，都说蛋白反复冻融会降解，这些蛋白还要用于ELISA筛选的抗原，大家快帮忙，谢谢！
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orangecake[使用道具]
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发表于 2014-6-28 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
先不要急于放在低温，4度放置应该不会很快降解，（当然时间不能太长）咪唑对小鼠有没有影响不太清楚，至少脱盐可以排除一个因素对动物实验的干扰，建议脱盐。小批量的蛋白可以使用milippore的超滤管浓缩和脱盐（脱盐应该多稀释几次，
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uuooii[使用道具]
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发表于 2014-6-28 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
milippore的超滤管浓缩是怎么回事？我没用过，我想用Tris.HCl缓冲液透析，因为最后的洗脱液中含有Tris.HCl缓冲液（PH=7.9），Tris.HCl应该不会影响蛋白的特性和干扰免疫小鼠吧！
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-6-28 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白如果是自己表达的话，你最好还是多表达纯化一些，毕竟你还要免疫小鼠（一般要6只以上，因为有些小鼠在免疫过程中，有多种原因可以导致其死亡），还要用你的抗原去筛选单抗（这也需要很多抗原）。然后用透析，或者凝胶柱去脱盐。透析，并不会象你说的会使蛋白量损失很大，有那种径较小的透析袋。由于你的咪唑浓度很高，你可以先用蒸馏水透析（2小时左右），在用PBS透析。
另外提醒你一下，你完全不必用这么高的咪唑浓度去洗脱，一般的蛋白200-300　mM的咪唑就可以达到完全洗脱了，你可用梯度（连续梯度或者阶段梯度法）去摸索一下洗脱条件。
二楼所说用milippore，只能达到浓缩效果，却不会降低盐浓度。
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发表于 2014-6-28 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还想问一下，我透析完了，怎么知道咪唑已经透析出去了，或者没有咪唑了昵？
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ha111[使用道具]
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发表于 2014-6-28 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
透析，并不会象你说的会使蛋白量损失很大，有那种径较小的透析袋。由于你的咪唑浓度很高，你可以先用蒸馏水透析（2小时左右），在用PBS透析。
用蒸馏水透析，那我最后得到的蛋白岂不是很稀，我是用Tris HCl透析的，最后还需要用PBS透析吗？
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2014-6-28 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
二楼所说用milippore，只能达到浓缩效果，却不会降低盐浓度。

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超滤进行diafiltration，可以有效降低盐浓度。
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dog002[使用道具]
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发表于 2014-6-28 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
买个柱子把,用sephdex系列来脱盐换液是比较不错的选择,你可以买来自己装,液可以买很小的柱子,就像NI柱大小的,你可以去AMERSHAMR公司目录查查,
浓度也控制的不错,呵呵,这个公司的(GEL FILTRATION)上看来的,我也要买柱子,所以不对请大家指正.谢谢!!!
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dog002[使用道具]
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发表于 2014-6-28 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

关于蛋白的保存,我建议你看看蛋白质纯化和鉴定指南这本书以及这里的(从纯化到星辰),很好的两个指南,呵呵!!!
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-6-28 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

透析过程中出现沉淀，很有可能是你纯化的蛋白的等电点与PBS相近，你可以试试用vectorNTI或其它软件测一下蛋白的等电点，然后调整一下PBS的pH值，或许会有帮助
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