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标题:【求助】蛋白显影全部都是杂带 ,比目的条带还亮的多

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发表于 2014-6-28 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白显影全部都是杂带 ,比目的条带还亮的多


请问各位大吓,我最近做western 我的蛋白的目的大小是43kDa,我是做兔的平滑肌细胞,由于市面上没有抗兔的一抗卖,在老板的叫我赶快做实验出结果的压力下 我包括我老板发现了有几篇文献(国外的,估计是美国老的)他们也是做兔子,他们用的一抗是zymed公司的兔抗_Cx43,由于不是抗兔的抗体 对于它 我一直很怀疑,但是我老板却认为 一定没问题,所以就买了.在我最近做的过程中,我电泳10%的胶,集成胶100伏特半小时,分离胶200伏特1小时,跑完的时候我的预染mark在30的地方离胶下缘还有点距离,43的蛋白应该不可能跑出去,我转膜过夜,恒流0.1 15小时, 转完和立春红染色 很漂亮 很清楚,然后封闭2小时,一抗2小时 ,2抗两小时 , 暴光,我做了几次 改变了tween20的浓度 , 一抗 2 抗的浓度,但是我的结果每次都是一样 ,不是我要的条带很亮,我的目的条带很淡.而且杂带特别多.由于我的抗体不是特异性的 我在想会不会是我的一抗的问题 是不是和其他蛋白特异性的接触了?我很纳闷 请各位做过的人指点下我 ,我老板不讲道理的 他认为做的出就做的出,我做不出来就完蛋了 ,我面临的困难好大 !!!!!大家帮我 是我的技术的问题还是我的一抗的问题 ???
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发表于 2014-6-28 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
封闭时间太短。我一般是转膜1小时，封闭过夜的。
还有一抗的稀释度是多少？不能太高，还有加二抗前洗膜了没有，洗了多久？还有二抗的稀释度是多少？在追求特异性的角度下，可以尝试尽可能的降低二抗浓度。
不过按说封闭不够、抗体浓度过高等，只会增强非特异性，该显出来的带应该还是能显出来。如果显不出来，或者信号过弱，那么抗体的选择估计也有问题。
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发表于 2014-6-28 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有个方法可以试试:你在洗膜的时候把TBST中NACL的浓度提高到0.3mM,盐浓度的提高可以更有效的洗脱掉非特异结合的一抗.
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发表于 2014-6-28 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老弟：首先做实验千万别急，身心疲惫的情况下，很难做出漂亮的结果。
最近我在做肾脏组织及细胞的a-平滑肌肌动蛋白表达，我订的一抗是单克隆的，但在说明书中清楚地写着，一些同源性较高的种属也可做，因此我想只要你的说明书中列出你目前所做的种属，就应该没问题。
此外，洗膜的时间很关键，建议15min*3次，常温下摇床振荡。封闭时间可在2小时左右，同样常温下摇床振荡。
祝你成功！
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发表于 2014-6-28 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你们说封闭过夜会比较好吗 会不会对正常的蛋白有影响呢? 把正常蛋白也封闭了就糟糕拉 , 还有 回复tlynn 美女 ,我的抗体的说明书上写了是针对大鼠 小鼠,人 的 其他种类的的在wb中未检测到.我请了我老板娘 她是上海2医科大的博士毕业回来的 专门做wb,她觉得可能是我的一抗有点问题 ,我也很怀疑,我还没尝试过封闭过夜, 我下次尝试一下看看,谢谢你们 .我爱你们!!!我下次封闭过夜!!! 对了 告诉你们 我每次都洗膜3次 每次10分钟,我觉得应该不是这里的问题 .......
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发表于 2014-6-28 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
封闭过夜只会把膜上未被蛋白覆盖的空处填满，已经结合了蛋白的是不可能再盖上的，除非你的蛋白能跟BSA有结合位点了。
洗膜时间越长，换的次数越多只会对降低非特异性有帮助。
此外，你封闭液用的是什么？
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 小中大
你好 我用的是5%的完达山的脱脂奶粉,封闭2 小时,我帮别人做了一次 也是封闭两小时 , 那个人的一抗是特异性的 (我的不是)我做出的条带很明显 ,虽然那人的一抗也是多克聋的,, 你再给我点建议好吗?
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发表于 2014-6-28 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议只有一个，换一抗。是抗体的问题。不过你可以试试同时跑个人或小鼠的蛋白做对照，看看结果怎么样。在一张膜上做，这样你老板没话说了，而且你自己也会有把握。再就是兔子里面的这个蛋白和人、小鼠的蛋白分子量一样么？
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 小中大

恩 我想过 不过我这个蛋白的肿瘤细胞里面表达量很低下 我这里就我一个人做正常细胞 ,其他的都是在做癌细胞 还有做心肌的 ,肯定是不会给我的!!!诶 我也不知道怎么办才好 ,人的和老鼠的 我的这个蛋白分子两都是一样的 都是43
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