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标题:【求助】低水平表达的重组蛋白的纯化问题

fqswdzd[使用道具]
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发表于 2014-6-28 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】低水平表达的重组蛋白的纯化问题

我用pET28a（+）载体克隆了一个接近500bp的基因，经测序验证正确。理论上表达的重组蛋白18.5K。但诱导含重组质粒的BL21（DE3），在考染的SDS-PAGE上看不目的条带，但WB能检测到。
我试图通过过亲合柱的方法来达到浓缩的目的，25度的低温下诱导48小时（含重组质粒的BL21生长非常慢），1mM IPTG，1L LB浓缩到30ML，超声破碎后上清过柱（Ni2+亲合柱，Amersham）。但我始终看不到洗脱峰。
请高手帮帮忙，指点一下，我应该怎么才能拿到这个蛋白？我不需要很多蛋白，只要能在考染下看到条带的量就足够了。非常非常感谢。
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发表于 2014-6-28 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的表达条件都很奇特，你确定你的蛋白表达了吗？
另外，超声条件也很怪，不知道你从哪里参考的
建议你改进一下表达，再做纯化
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发表于 2014-6-28 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

诱导表达的条件是自己慢慢摸索的，因为开始我30、37度诱导4到6小时，SDS-PAGE考染看不到目的条带，后来就尝试用更低的温度更长的时间，但仍然不行。于是我想用亲和层析来浓缩表达的目的蛋白。（蛋白确信能表达，而且表达量很低）。
超声条件我说的简单了些，补充一下，我将1L菌液离心后，用1*Binding buffer30ml重溶，超声破碎，离心，上清0.45微米的滤膜过滤，然后就上柱。
不知道westwin说改进一下表达，如何改进？Thanks a lot.
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发表于 2014-6-28 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

表达确实很麻烦，如果你的蛋白的表达量太低，在纯化时，蛋白挂柱量也会很少，可能无法看到洗脱峰。看了你的超声方法，应该是没有问题。我认为尽可能提高表达量是非常必要的。
1、低温诱导时菌体代谢肯定要慢，表达量通常会比较低，建议提高诱导温度。也可以尝试热激，可适当提高表达量。
2、可以适当加大抗性选择作用，提高质粒浓度，也有可能使表达量提高。如果我没有记错的话，pET28应该是Kan抗性，你可以增加到原来的3倍浓度。
3、换表达宿主，或许是你目的蛋白的表达不适合你当前的表达宿主。换能提高表达的宿主菌，比如BL21 origami（DE3）。
4、看看你的目的蛋白是否对宿主有毒害作用（你说到过你的菌生长缓慢）。
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发表于 2014-6-28 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在也在着手提高蛋白表达量。等我如果真的能提高了，我再来和大家分享。
我想请问zhangqw1978，热激是怎么做？原理是什么？
pet28的确是kan抗性的，但我记得有一次我在做平板的时候，我kan加成原来的二倍，结果菌就长的非常小了，我估计高浓度kan应该会抑制菌的生长。我平时用的kan浓度是50ug/ml。
BL21 origami(DE3) 好象是增加细胞质中二硫键的形成的吧。不过如有可能我会考虑换表达宿主菌的。
最后一个问题，任何确定目的蛋白对宿主有毒害作用呢？
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发表于 2014-6-28 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

热激是指先低温摇菌，当到达诱导的菌浓度时，加入诱导剂后提高温度，达到提高菌体代谢水平，适当提高相应目的蛋白的表达量。我们实验室有做过30到37，30到42，37到42等。但要注意的是，热激通常容易形成包涵体。
如果加大抗性浓度会影响菌体生长的话，那么这种方法就不可选了。
在尝试了表达条件筛选仍没有效果以后，最好的办法就是换表达宿主。
目的蛋白对宿主有无毒害：通常有毒害会表现出一些特征，如菌体生长非常缓慢、或者当菌体浓度达到一定程度时，菌液开始变得澄清、还有就是目的蛋白本身就是一种会影响宿主菌生长的抑制剂等，如目的蛋白是抗菌物质。如果真是有毒害作用，肯定会影响表达量。可以在未诱导时降低菌体对目的蛋白的本底表达进行改进。比如，如果是T7启动子，可以在摇菌时加入一定浓度的葡萄糖，抑制本底表达。但是在诱导时应换用无葡萄糖的新鲜培养基。
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 小中大
我用pET28a（+）载体克隆了一个接近500kb的基因，经测序验证正确。理论上表达的重组蛋白18.5K。但诱导含重组质粒的BL21（DE3），在考染的SDS-PAGE上看不目的条带，但WB能检测到。
我试图通过过亲合柱的方法来达到浓缩的目的，25度的低温下诱导48小时（含重组质粒的BL21生长非常慢），1mM IPTG，1L LB浓缩到30ML，超声破碎后上清过柱（Ni2+亲合柱，Amersham）。但我始终看不到洗脱峰。
请高手帮帮忙，指点一下，我应该怎么才能拿到这个蛋白？我不需要很多蛋白，只要能在考染下看到条带的量就足够了。非常非常感谢。
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pET28载体表达，一般6h足够了，不需要过夜，你可以比较一下不同诱导时间的蛋白含量有无变化的趋势，另外，建议先做小试管的梯度实验，考察一下诱导温度、诱导剂浓度、诱导时限对表达的影响
一般来说，这个载体的表达条件是：25度，0.05mM IPTG，4－6h
另外，我想知道你如何将1l菌液浓缩到30ml的
可以先离心，菌体－20度冻融一次，然后按照1：6的质量体积比加入lysisi bufer，需要加1 mM终浓度的PMSF或其它蛋白酶抑止剂，然后冰浴超声，超声剂量可以用400w－600w，超5秒，停5秒，200到300循环，通过镜检观察是否破菌完全，超声过量会断裂蛋白。
你的蛋白表达量应该不高，上柱纯化后可能会看到PAGE条带
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 小中大
我今天已经测了重组菌在37度，50ug/ml的条件下重组菌的生长曲线和诱导重组菌的生长变化（1m IPTG，OD600=0.6 时开始诱导）。但前天没把含空质粒的BL21（DE3）接进去，所以明天重做，呵呵。
从今天的结果来看，没有诱导的重组菌长的非常快，直到OD600=5左右后才开始有所回落（如果OD值没有在0.1~1之间的话我稀释菌液后将读数乘以相应的稀释倍数）。但诱导后的菌，在加入IPTG1.5小时后达到最高约1.3后不断下降，再6小时后就只有0.6多一点后我就没有再继续测下去了。如果只从今天的情况来看，能说明是有毒吗？
我还将没有诱导的重组菌在OD 0.6, 1.0,1.8 三个读数的时候，分别取一定样品稀释10-6 倍后涂板（有抗生素和无抗生素各一块），看质粒是否丢失，但要明天才看的了结果。
当然，我明天把重组和空质粒的都测了可能才能说明问题。
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 小中大
PET28 是T7lac，IPTG的浓度PET手册上说1.0ml才能完全诱导。不过，我会去做来比较一下的。
浓缩就是离心，弃上清后菌体用30ml溶咯，可能你觉得太浓了吧，但实际上能溶。大不了多超声一会。
我冻融了的，但没加蛋白酶抑制剂。我最近也在想，是否需要加。所以想请教一下，什么时候确定需要加蛋白酶抑制剂呢？
我没镜检，就看到菌液澄清了就离心，粗了些，下次一定看看。谢谢。
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-6-28 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从你描述的情况来看，说明在加入诱导剂后菌体确实有裂解的情况，如此看来，很有可能存在目的蛋白致宿主菌毒性。建议如westwin朋友所说做个时间梯度， 了解什么诱导时间蛋白表达量高，直接在此时间收菌，低温（最好加PMSF等蛋白酶抑制剂）。既然菌体降解，更能说明目的蛋白的表达。宏观上看，菌浓度降得快的时候应该就是蛋白表达量高的时候，可稍微提前一点收菌。
你已经做了生长曲线，看看线性规律，选一个表达量高的时间点收菌纯化蛋白吧，祝你好运！
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