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标题:【求助】做蛇毒的请进来交流！

yueban-1147[使用道具]
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发表于 2014-6-28 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】做蛇毒的请进来交流！

我也是做蛇毒的，眼镜蛇蝮蛇都做，不过现在遇到了麻烦事请各位大哥帮一把：
做类凝血酶需要用BAEE测定精氨酸酯酶活性，单位是怎么定义的呢，文献上的说法都不统一？
测定类凝血酶凝血活性时需要用纤维蛋白原，可是好多厂家都没有这个产品了，拜托大家帮忙了，在此先谢谢！
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wood533[使用道具]
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发表于 2014-6-28 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老早以前以前做过，单位是很多，不过多是一定温度下吸光值的单位变化．大概国际单位的活性变化太大用起来不方便所以才有更多使用方便些的单位吧．具体如何要查到原文了．　纤维蛋白原我以前用Ｓｉｇｍａ的，不过很贵，通常实验用人血浆代替了．好象也有国产的，上网查一下吧．
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发表于 2014-6-28 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

纤维蛋白原用中国生物制品检定所的。人纤维蛋白原太贵，用牛的可以替代，写文章时注明就可以了。至于精氨酸酯酶活性单位，一般文献上都有，比较统一。但做纯化表时，一般不用精氨酸酯酶活性来确定。最常用的是NIH单位。三肽底物也可，但三肽底物也奇贵无比。若你实验室有酶标仪，建议你用BAPNA405nm检测波长。
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发表于 2014-6-28 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我这里检测精氨酸活性时，
采用DAEE法，
但是在紫外下检测得到的数据极不稳定，
请问问题有可能出现在哪里？
或者有没有其他方法检测精氨酸酯酶活性？
谢谢！
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2014-6-28 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

真的好谢谢各位的帮助！
人纤维蛋白原我在网上买到了，是广州新特药店卖的上海莱士生产的，不知道大家用过没有，价格还算比较便宜了。
BAEE方法测定时是特别的不稳定，所以我感觉它只能用来说明是否有精氨酸酯酶活性，没法定量的来测定。^_^文献上有好多就这样给出定量测定的单位了，不知是怎么做出来的，哪位仁兄做过可以详细交流一下了，呵呵
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2014-6-28 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您说：若你实验室有酶标仪，建议你用BAPNA405nm检测波长。能不能把这个方法再说的详细些，我们实验室有酶标仪可以做的，呵呵
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dog002[使用道具]
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发表于 2014-6-28 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

将BAEE 用0.01mol/L pH 值7.6 Tris－Hcl缓冲液溶解, 配制成终浓度0.01mol/L 的BAEE溶液;取上述配制的BAEE溶液1.0ml加入10ml具塞试管中,30℃水浴保温2min,精密加入供试溶液0.2ml摇匀,继续保温5min,取出立即加入碱性盐酸羟胺溶液2ml停止反应, 1min后加入4mol/L盐酸1ml。再加入10%三氯化铁试液1ml显色。在540nm 波长处测定酶的减少，以在30℃下1min分解底物1μg分子的酶量作为1个精氨酸酯酶活性单位。
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2014-6-28 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

方法和BAEE法差不多，用BAPNA的办法主要是纯化后，做活性曲线比较方便。具体方法，查一查文献就可以了，BAPNA和BAEE的区别就是生色基团不一样，PNA的最大吸收波长为405nm，用96孔板测比较容易，但是要有排枪。如果你实验室的酶标仪的吸收波长范围包括253nm，那么用BAEE测活性也可。建议你用BNPNA测活的原因是因为在我们实验室酶标仪的吸收波长为400-700之间，所以用不了BAEE。
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2014-6-28 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
将BAEE 用0.01mol/L pH 值7.6 Tris－Hcl缓冲液溶解, 配制成终浓度0.01mol/L 的BAEE溶液;取上述配制的BAEE溶液1.0ml加入10ml具塞试管中,30℃水浴保温2min,精密加入供试溶液0.2ml摇匀,继续保温5min,取出立即加入碱性盐酸羟胺溶液2ml停止反应, 1min后加入4mol/L盐酸1ml。再加入10%三氯化铁试液1ml显色。在540nm 波长处测定酶的减少，以在30℃下1min分解底物1μg分子的酶量作为1个精氨酸酯酶活性单位。

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是不是在540nm处测定底物的减少啊，^_^
还有，那是不是要建立BAEE和三氯化铁试液反应的标准曲线，然后查找出测定出的值对应的BAEE ug数了？
我没有做过，所以问题比较多，不好意思了哦。能不能把这个方法的原文件发给我看看，呵呵，我找到的方法和你的都不一样
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dog002[使用道具]
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发表于 2014-6-28 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个方法是用540nm处测定 底物 的减少,疏忽了,抱歉!
配制不同浓度的BAEE标准溶液,通过显色反应建立标准曲线,这样就能对应找到BAEE的值了.
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