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标题:【求助】请问用凝血酶thrombin酶切gst蛋白的问题

newway[使用道具]
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发表于 2014-6-28 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请问用凝血酶thrombin酶切gst蛋白的问题


请问用凝血酶thrombin酶切gst蛋白时，采用bovine小牛规格的酶可以吗？纯度为77％，但稀释跑胶发现有多条杂带。是否有必要用专门的restriction级别的，谢谢
另外，酶切时间和温度多少比较合适，我纯化后发现有不少杂带，是否是酶切条件不合适引起的？
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XYZQ[使用道具]
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发表于 2014-6-28 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们用Sigma的，纯度很高，就是贵一点
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newway[使用道具]
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发表于 2014-6-28 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 XYZQ 于 2014-6-28 16:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们用Sigma的，纯度很高，就是贵一点

请问是限制级，有没有指明是用来做酶切的，价格大概多少啊，我买的那个纯度是77％，1000个单位300多，酶切也能比较彻底，就是有很多杂带
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eve_49[使用道具]
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发表于 2014-6-28 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵,楼主
我告诉你吧,一般的酶效果就很好了,我买的1000单位70元的,酶切后目标蛋白中的杂带就很少了
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发表于 2014-6-28 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 eve_49 于 2014-6-28 16:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

呵呵,楼主
我告诉你吧,一般的酶效果就很好了,我买的1000单位70元的,酶切后目标蛋白中的杂带就很少了

你说的这个凝血酶在哪里买的呢？能否发pm给我
另外，你说的酶切后目标蛋白少了，是指酶切前的杂蛋白在酶切后没有了吗？谢谢
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eve_49[使用道具]
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发表于 2014-6-28 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #5 newway 的帖子

对,纯度几乎就是99.99%
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eve_49[使用道具]
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发表于 2014-6-28 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

凝血酶是天津血液研究所的,非常杂,但量少,纯化后,在目标蛋白中就看不到了,目标蛋白可达99%,
另外，你想问的GST蛋白的纯化遇到比较多的问题，我也是有很多问题,我看你都是中级战友了,还想多向你请教呢
我的也是有杂带,但纯度都有在90%左右或者更高,别人说的,我还不知道怎么估计,不太相信软件
我今天发现在pbs 里加1M氯化钠洗杂蛋白,gst蛋白不会被洗下来
还有用0.002M的gsh就可以把gst蛋白洗下来了,节约了好多gsh呀,呵呵
gst亲和胶用几次效果就差了,不知你有再生过嘛?
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gemei0115[使用道具]
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发表于 2014-6-28 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我马上也要做GST酶切了。我认为还要把thrombin从目的蛋白中去掉啊（再过一次离子柱或分子筛）！另外，听一位老师说，目的蛋白还要在洗脱液（PBS等）中保持可溶，否则没有活性啊！
请各位讨论、给高见啊！
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