小中大【求助】7.5KD蛋白Western blot 怎么办？
大家好：
我初次做试验就碰到一个难题：蛋白分子量只有7.5KD大。
做了十多次都没有成功，是哪个地方出了问题？？？
做的好累了，谢谢好心的XDJM
下面是我的试验步骤：：
Western blotting 的方法步骤
第一天：
脑组织蛋白的抽取：
⑴ 取小鼠海马、文状体、前皮质组织 ～200mg加1ml全细胞裂解液（组织裂解液（全细胞蛋白提取）：1：Tris-HCL50mmoL/L(PH7.4) 2: Nacl 150 mmoL/L 3: 去氧胆酸钠 0.25% 4：NP-40或Triton-x-100 1% 5: EDTA 1 mmoL/L 6：PMSF 1 mmoL/L 7：Aprotinin1μg/ml 8: leupeptin 1μg/ml 9: pepstain 1μg/ml），手动冰上快速匀浆。
⑵ 14000rpm离心40min
⑶ 上清即为抽取的蛋白，吸出分装，进行定量。（-20℃保存）
⑷ 将所有蛋白样品调至等浓度
电泳
制备聚丙烯酰胺凝胶：
1、 注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
2、 SDS-PAGE 胶的配制
15%
30％丙烯酰胺 (ml) 4.0
4 X resolving (ml) 2
ddH2O (ml) 3.87 2
10%AP (μl) 40~~~~~~~~~~~~~~80
3、 混匀后小心将分离胶注入准备好的玻璃板中，到达第一条横线。
4、 封胶
5、 待胶凝后将封胶液倒掉，如用已醇封胶
6、 配制5％浓缩胶：插入梳子，室温下放置1小时左右。
5％浓缩胶
30％丙烯酰胺 (ml) 0.35
4 X stacking (ml) 0.75
ddH2O (ml) 1.97
10%AP (μl) 20~~~~~30
7、 灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。
8、 加样
1）、小心移去梳子，将凝胶电泳板放入电泳槽，用夹子夹紧，然后在上下电泳槽中分别加入电泳缓冲液（running buffer）并使上槽缓冲液浸没胶面。
2）、上样前将胶板下的气泡赶走。
3）、电泳：预电泳： 将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。接通电源，电压120－130V，当染料的前缘接近凝胶的底端2cm，断开电源
转膜
1、电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：剪一块与胶大小一致的Hybond－P 膜，在甲醇中泡10 秒钟，再在转移buffer(transfer buffer)中浸泡10分钟，同时切下的胶也在转移buffer(transfer buffer)中浸泡一会儿然后按黑多孔板－>吸水隔层－》滤纸－》胶－＞膜－>吸水隔层－>白多孔板顺序将膜和胶叠好,排尽空气,放入槽中加入冰盒,倒入转移buffer(transfer buffer)。转膜时在冰块中进行。
2、36V恒压转膜2.5小时左右。
4、膜用塑料盒装好，加入封闭液（5％脱脂奶粉＋0.1％Tween20【Washing buffer】）封好盒子。室温摇床孵育30min。
5、倒掉封闭液，加入一抗（4℃过夜。（一抗用封闭液稀释）
第二天
1、 将膜用Washing buffer洗20分钟X 3。（用培养皿）
2、 将膜放入塑料盒中，加入HRP标记的－goat-anti-rabbit二抗,封好盒子。室温摇床孵育1小时。
3、 Washing buffer洗20分钟X 3。（用培养皿）
4、 PBS洗几次（用培养皿）
5、 在一保鲜膜上以1：1配制ECL，均匀滴加于膜上，作用5min，甩干膜，置于另一保鲜膜上包好显影（避光进行）。
谢谢！！
非常感谢！！
