【求助】多肽的纯化

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标题:【求助】多肽的纯化

whitesheep[使用道具]
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发表于 2014-6-30 15:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

现在本人有一多肽，是通过基因***表达的，表达后是包含体，奇怪的是我对包含体洗涤后，电泳显示杂蛋白没有减少，目的蛋白的量反而减少了不知道是何原因?
***后分子量为30kd 单体分子量约为3kd，pi4.5左右。我酶切得到单体后，用反相hplc纯化，发现纯度始终在70％左右，现在我想先过个分子筛，不知道在酶切之前过筛呢？还是酶切后过筛呢？望大侠给点建议。

ero11[使用道具]
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发表于 2014-6-30 15:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果是形成包涵体的话，洗涤后目的蛋白应该不会减少太多的。不知道你的洗涤条件是怎样的，是不是操作上造成的？
如果是用的反向纯化的话，纯度应该可以达到95％以上的。你的只有70％可能是条件不行。分子筛不知道你是准备用于进一步纯化还是脱盐用，需要看你的用途。

windy+++[使用道具]
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发表于 2014-6-30 15:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你酶切后的单体纯度高吗，反相HPLC大概没法分开多聚体和单体。我想你可能是没有酶切完全的原因。如果用分子筛建议在酶切后用，因为分子筛不仅可以分开杂质和目的蛋白，还可以分开多聚体和单体

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发表于 2014-6-30 15:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

pi4.56左右,还是用阴离子比较好吧

whitesheep[使用道具]
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发表于 2014-6-30 15:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

酶切后分离单体，这位大侠能否给点建议，为什么用阴离子啊，在这个方面我是在是采鸟啊。

ero11[使用道具]
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发表于 2014-6-30 15:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

因为你的pi是4.56左右，如果使用离子交换层析，缓冲液pH建议用大于你的pi值，如7.0或8.0，此时你的蛋白带负电荷，能和阴离子交换柱上的阴离子交换，如果用低于你的pi值的话，此时pH过低，容易造成蛋白变性或失活。
另外，建议你把你的问题说清楚一点，你前面的帖有几个地方全是****号，看不明白

qqq111[使用道具]
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发表于 2014-6-30 15:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我建议你过了筛后再酶切，这样杂蛋白要少些，酶切效率也会高一点。