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标题:【求助】western转膜中的疑问

yyaxw84[使用道具]
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发表于 2014-6-30 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western转膜中的疑问


本人现在努力的在转60kd大小的蛋白,转膜时间为2h,恒流250mA,每次预染的marker都转到了PVDF膜上,但是转膜后的胶上总是有很浓的蛋白,同时膜上没有特异性 的条带出现,很是郁闷.请高手指点!
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nut6694[使用道具]
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发表于 2014-6-30 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

60 KD 的蛋白并不是很难转。你提供的条件有点少，我胡乱说说看。
我个人转过膜之后不测定胶上的蛋白，但是我的条件是20v 60min恒压转膜。和园子里的很多人的用法不同，但是做的也是不错的。
你的原因分析
首先保证你的蛋白提取没有问题，每个步骤都要快，不要耽误时间。
转膜根据分子量大小调整时间长短，我用的是BIO-RAD的半干转膜仪，20v，60min对于60KD的蛋白完全够用。你的如果感觉转膜不充分，在延长时间或是提高电流，摸索合适的条件。
另外，一抗的孵育是最重要的步骤，这一步是能否成功的绝对关键。调整时间，浓度，甚至公司有时又都是必须的，具体问题具体分析。
一家之言，仅供参考，祝你好运！
WB是一个很多步骤地试验，细节很多，多学习园子里的高手，多自己揣摩，相信你会成功。
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发表于 2014-6-30 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

2 hours is too long.
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发表于 2014-6-30 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那么请教150kd的恒压半干转条件？不胜感激
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yyaxw84[使用道具]
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发表于 2014-6-30 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感谢大家的帮助，但是我认为我的转膜时间不是过长，因为我的胶上的蛋白还有很多没有转干净。我的上样量是60ug，同样的上样量我在别的试验室也作了一次，他们的仪器和我们的一样的，都是bio-rad的，他们的转膜条件是250mA转2小时，转完的膜很干净，是不是我们的电泳转膜装置有问题呀， 我们可是新买的呀！！
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发表于 2014-6-30 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

western-blot的差异可真大啊
我们也是60kd左右的蛋白
100V转60min就足够全部转到膜上了啊
不过跟电流也有关系
如果电流小于0.2A的话就要多转5-10min
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发表于 2014-6-30 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

200V for 1 hour is enough to transfer to the membrane. Is your transfer buffer OK? You need to use freshly prepared transfer buffer
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gogo[使用道具]
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发表于 2014-6-30 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我在转127kd的蛋白，转移后的胶染色没有条带，但膜用立春红染色却染不出来，请教。最近一次转膜稳压100v，但是电流一直在升，是为什么呀？急！
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wood533[使用道具]
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发表于 2014-6-30 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也是用BIO-RAD半干转印系统,30V 1h10min,转膜后将胶染色,只有大分子的条带转得不完全,其余基本转移,效果不错。
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发表于 2014-6-30 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人建议：
我一般使用100-110mA的稳流，在低温4度转膜两个小时，都能成功的。
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