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目的蛋白中，His-tag中的咪唑基团的电离度与pH值相关，提高wash buffer的pH值有利于目的蛋白与镍的螯合，从而使目的蛋白与柱结合率提高。我也曾经用过pH约7.4的wash buffer洗脱杂蛋白，出现了目的蛋白与杂蛋白同时流出的现象，后来提高pH到8.0，效果明显好转。同时在平衡液（我使用的也是pH8.0）中加入低浓度的咪唑也可以使杂蛋白的结合率降低，当然同时对目的蛋白也稍有所下降，但不至于影响与柱的结合（建议在10-20mM以内）。对于洗脱目的蛋白时，可以将pH有所下降，我当时使用的elution buffer（300mM）的pH为7.4。这样目的蛋白的洗脱速度比较快，相当于适当的浓缩了目的蛋白。我记得当时我在洗脱目的蛋白时加大流速后，目的蛋白洗脱峰很漂亮，整个峰的时间大概两三分钟（当然我是小柱10ml），体积大概在10ml左右。以上纯属本人的初见，但望高手指正。
