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标题:【求助】western blot转膜

zranqi_1[使用道具]
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发表于 2014-6-30 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western blot转膜


如题所问，谢谢
近期要做western blot半定量，内参为42kda，另外三个目的蛋白的分子量分别是60kda、75kda、85kda。请问我可以同时转膜并且按分子量切膜后分别检测吗？
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yychen[使用道具]
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发表于 2014-6-30 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该可以的，但你的MARKER一定要精确！
建议跑胶的时候要有足够的 时间。
由于你的分子量很接近，所以一定要跑长一点时间，你可以通过摸索使你的42内参基本上跑到胶的最下面，只要不跑出去就行！
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发表于 2014-6-30 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也想问一下楼主，你做三个蛋白，用三个单抗，是同时加入三个，还是一个一个加。如果是分别加，那第一个单抗、二抗、显色完怎么处理在加第二个？
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zranqi_1[使用道具]
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发表于 2014-6-30 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想一块跑胶、转膜，然后根据maker的提示切膜，最后分别加一抗、二抗。
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2014-6-30 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的意思是把你大概分子量的那个膜切下来然后加一抗嘛。那你用的marker有多精确，都指示多少分子量，你的蛋白离的那么近，能保证三个切的膜包括你的蛋白吗。
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zranqi_1[使用道具]
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发表于 2014-6-30 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

其实究竟可不可以，我也还不是很清楚。不过我查过了，晶美代理的公司里有很精确的marker。我也很担心我的目标蛋白能否一起转膜，能否在marker的指示下切膜。
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发表于 2014-6-30 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个没问题.可以切的,我们一张12厘米宽长6厘米的膜可以跑21个样品,然后在切条子做.只是你要尽量调整好电泳时间,目的条带尽量跑开
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jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2014-6-30 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

同时加两种一抗行吗？或者一种抗体孵育发光后再用同一张膜与第二种抗体反应行吗？谢谢！
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-6-30 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我刚做完western ,也遇到过类似情况，谈一点我的体会，不知对你有无帮助，也请高手指正：我觉得marker可以很精确，但是由于蛋白修饰的原因，你分离出来的目标蛋白的分子量不一定跟理论值的完全一致。所以我觉得按marker切膜不太保险。我的做法是转完膜后用丽春红染色，然后将膜按每1－3道剪成小条，每条测一个目的蛋白，另选一条测内参，显色后根据条带分膜，若条带太近则调整电泳时间在重复上述操作，直至可以分离，采用此种方法我在一张膜上检测过相差5KD的两个蛋白。另外，可以同时加三个一抗测三个蛋白，但要保证二抗是一致的，还要做好预试，实验中什么情况都可以发生，有时是找不到原因也无法解释的。
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remenb[使用道具]
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发表于 2014-6-30 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果担心目的条带太靠近不好分开切膜的话，我建议用洗脱抗体的办法。就是一种抗体发光后，用抗体洗脱液洗膜，然后再加另一种抗体进行检测。具体的洗脱液配方及洗膜方法，因我是在两年以前做的，现手头上没有具体资料了，只好请你找CST公司的目录书了，后面有详细的Protocol，找不到的话，碧云天有这种抗体洗脱液卖，应该也有相应的说明步骤的。我以前是参照CST提供的Protocol的，做出来的结果很漂亮。
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