蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】关于聚丙稀凝胶电泳有个问题

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】关于聚丙稀凝胶电泳有个问题

veiwu[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 107977
精华 1
积分 513
帖子 662
信誉分 102
可用分 4122
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
1

发表于 2014-6-30 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于聚丙稀凝胶电泳有个问题


我在做westernblot实验。一直都比较顺利，但是最近跑胶时出现问题，一直让我迷惑不解。跑胶时溴芬兰指示剂迟迟不下来，有时跑一天溴芬兰都在浓缩胶里面。这是为什么呀。我最近换了新的temed和上样缓冲液，但是胶都是半个小时都凝了，上样缓冲液是买的同一个公司，同一个型号的，以前一直用也没有出现问题。10%的sds是四个月以前配的，是不是失效了。我做胶的各个成分都没有变，电泳缓冲液都是用tris-甘氨酸缓冲液，用恒压，最后都用到200v，跑的电泳槽都很热了，还是跑不下来。到底是什么原因呢？急死人了，实验都要结束了，又出现这个问题，有没有高手指点一下呀

[ 本帖最后由 veiwu 于 2014-6-30 17:34 编辑 ]
顶部
zranqi_1[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77471
精华 0
积分 409
帖子 497
信誉分 100
可用分 3298
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
2

发表于 2014-6-30 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先声明我不是蛋白高手，相互学习吧
你说胶都是半个小时都凝了，我觉得应该不是胶的问题，
10%的sds四个月是没问题的，配了一年的我都有用过，没啥问题的。
用恒压，最后都用到200v，跑的电泳槽都很热了，还是跑不下来。根据这个来看可能是电路不通吧
建议：
1、检查一下你跑电泳时配胶用的胶条 是否已去掉
2、检查一下缓冲液有没有漏液，以致凝胶上端露在缓冲液外
顶部
newway[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76575
精华 0
积分 505
帖子 689
信誉分 100
可用分 4253
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
3

发表于 2014-6-30 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不要急，实验是这样的 Smile
按照你说的溴芬兰跑不下来应该是胶或buffer出了问题，但是你说buffer没换，那就是胶有问题了，另外看一下电流的变化，有没有可能是电路连通情况不好。关于胶，一般来说是AP出问题，建议换一下，另外你换过TEMED,所以也用一下别人的试。
祝好运！
顶部
kuaizige[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76978
精华 1
积分 526
帖子 707
信誉分 102
可用分 4338
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-11
状态 离线
4

发表于 2014-6-30 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看看制胶缓冲液和电极缓冲液的pH对不对，浓缩胶一般6.8，分离胶8.9。
顶部
wmp1234[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79925
精华 0
积分 588
帖子 855
信誉分 100
可用分 5078
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态 离线
5

发表于 2014-6-30 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我不是什么高手，但是做过几次电泳，你说你的“有时跑一天溴芬兰都在浓缩胶里面”，我觉得应当是电泳槽的问题，看看有没有短路或者断路，有短路不经过电泳槽，但是你说"电泳槽都很热了",那就不应当是短路，看看连接吧，或者用测电表查一下。
顶部
veiwu[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 107977
精华 1
积分 513
帖子 662
信誉分 102
可用分 4122
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
6

发表于 2014-6-30 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢大家的帮助，我再换一下做胶的成分吧。关于电泳槽的问题，我仍然迷惑，我在跑胶的时候缓冲液会出现向上走的大量的气泡，这是不是说明电路没有问题呢？还有就是每次刚换了新的缓冲液的时候，把电压调到100伏时电流会在5ma左右，用的次数多了电流会到20-30ma，这是不是正常啊？我的电泳缓冲液用tris碱、甘氨酸、sds配的，配好之后我都没测ph值就直接用，这样可不可以？如何知道我的电泳缓冲液有没有问题呢？我每次配完之后都很担心我的各个组分是不是加的量不足。
顶部
tangxin_80[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79896
精华 0
积分 549
帖子 757
信誉分 100
可用分 4621
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态 离线
7

发表于 2014-6-30 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 veiwu 于 2014-6-30 17:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

非常感谢大家的帮助，我再换一下做胶的成分吧。关于电泳槽的问题，我仍然迷惑，我在跑胶的时候缓冲液会出现向上走的大量的气泡，这是不是说明电路没有问题呢？还有就是每次刚换了新的缓冲液的时候，把电压调到100伏时电流会在5m ...


、跑胶的时候缓冲液会出现向上走的大量的气泡是正常现象，因为电极在进行电解反应会放出气体，应该是氢起和氧气吧，物理差不多忘光了呵呵。
所以，你的电路应该是通的吧，要不就不会有气泡的拉。
2、但我用的也是甘氨酸缓冲液，好像电流要比你的大。缓冲液多次用过于后电流多会变大的，因为溶液中离子多的原因。
3、sds旧的应该没问题。俺用的多不知道是何时配的拉。
甘氨酸缓冲液配方（不知道和你的同不？）：
tris15.1g glycine 94g sds 5.0g 溶解后定容到1L.
祝好运。
顶部
bring[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74282
精华 0
积分 597
帖子 914
信誉分 100
可用分 5326
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态 离线
8

发表于 2014-6-30 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关于电泳缓冲液的问题，我们实验室的经验是可以反复使用，但最好不要一直反复使用，这样的话电泳的质量会越来越差的，一般反复用3－5次就可以了。再反复使用的话电泳的分辨率下降就比较明显了。我们是用双向来检测验证的，第一次使用的缓冲液跑出来的点边缘锐利，很清晰，而反复使用后点的边缘就模糊了，分辨率会下降，建议重新配电泳缓冲液。你说的跑到后面会发热就不会是电路不通的问题了，如果电路不通的话电流就是0了，这样是不可能发热的。我们用的是汪家政的配方：tris3g glycine 14.4g sds 1.0g ，直接配制，不用测pH值。还有，胶半个小时就凝固了，时间短了点，最好控制在1个小时左右比较好一点，这一点在郭尧君的书里有说明。
顶部
huifeng0516[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76210
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
9

发表于 2014-6-30 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我个人想法：主要可能是胶的问题，不然是不是你把胶板放反了？？？
顶部
fei1226com[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79957
精华 0
积分 599
帖子 898
信誉分 100
可用分 5286
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
10

发表于 2014-6-30 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

或许就是一个很简单的错误，很难觉察到的错误。胶板放反了也有可能。检查一下吧仔细点做应该没问题。祝你好运
顶部