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标题:【求助】SDS-PAGE蛋白质电泳参数设置

cocacola[使用道具]
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发表于 2014-6-30 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】SDS-PAGE蛋白质电泳参数设置


1.5cm*0.5cm*1mm的点样孔（75微升）点多少样品最为合适？
电泳参数我按指导书上的建议：
浓缩胶10mA(120V)
分离胶20mA(180V)
这样对吗？这些参数由哪些决定呢？电泳槽，样品分子量与浓度，
请各位师兄师姐帮忙。
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-6-30 17:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般上样为10到25微升,但是大多数情况下都喜欢上样10微升左右,因为过去的实验表明上样量多不见得跑出的条带清晰.
关于电压,不同的书有不同的版本,分子克隆上提到SDS-PAGE时,推荐的电压是浓缩胶60v-80v,分离胶100v-120v. 我一般选择的是70的100,跑出的MARKER不错,6条带都有,清晰.可惜的是我的样本跑不出.
祝你好运!!
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cocacola[使用道具]
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发表于 2014-6-30 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢！
我在网上搜到得一些参数加上实验室老师的数据，我选择了浓缩胶10毫安（120V）分离胶20毫安（180V）。跑起来还可以，只是到后来要把电压再提高才符合电流要求。看来实验参数都是摸索出来的，昨天一直守着那个陈旧的电泳槽了，呵呵。
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发表于 2014-6-30 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好现有的书上说在积层胶（浓缩胶）里电压为8v/cm,在分离胶里是15v/cm.
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cocacola[使用道具]
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发表于 2014-6-30 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问具体的出处在哪？我想看一看文章或其背景资料。
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2014-6-30 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般来说，上样量（体积）是根据你所要加蛋白质的质量来定，蛋白上样质量30～100ug都可以，如果质量少跑出来的条带好的话就尽量少一点，然后根据你所提的蛋白的浓度来换算应该加的体积量，当然最后的总体积（蛋白体积加上上样缓冲液体积）不能超过上样孔的容积，否则就应该减少上样量。
跑胶时，一般来说浓缩胶80v,分离胶100v~120v,这是恒压，当然你也可以设定恒流；但是由于电泳液在电泳时离子浓度会有所变化，再加上温度等的影响，因此电压恒定时，电泳过程中电流肯定会变化；同理，电流恒定时，电压也一样肯定会变化；所以你只要在电泳仪电源设定恒压或者是恒流，在电泳过程中就不用管另一个的变化了；但是，如果变化较大是不正常的，说明有短路（多见）或断路（少见）存在，要检查电泳槽。
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xue258[使用道具]
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发表于 2014-6-30 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们的上样量一般都在50微克左右，在跑胶之前用酶标仪以标准蛋白作标准曲线，再用待测蛋白的浊度作参照求出蛋白的含量。可以先做一次，如果结果条带分辨率不清楚，或者条带过粗，可以在下一次少上点量，但是一般都在30-100微克
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发表于 2014-6-30 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

通常两块胶同时电泳和一块胶电泳，以及电泳缓冲液是否重复利用，都会影响电泳时的电压和电流。我的原则是电流不超过40mA的情况下，浓缩胶60v-80v,分离胶100v-120v。效果不错。
上样量50-200ug较好，我一般用100ug，上样体积在10ul左右很好，所以蛋白质浓度在10ug/ul左右较好，提蛋白时足以荣蛋白的体积，若蛋白质太稀，可以浓缩一下。这样条带较清晰。
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发表于 2014-6-30 17:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不同的电泳槽使用的电压可以不同的。以六一厂的电泳槽为例，我们实验室24D的一般用80－100V，28A的一般用120－160V，24E的和28A的差不多。上样量是按你的样品中的蛋白含量来定的，而不是加样孔的大小。
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-6-30 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是六一产的24F.跑的是麦谷蛋白.分子量在10-150KD范围.用恒流.浓缩胶15mA.分离胶30mA.跑的还不错.带很清楚．可就是带太多.不知是蛋白没提好还是胶的C和T有问题.我用的是浓缩胶4%.分离胶12%.C2.67%.可在一些电泳书上看到12%的分离胶不能分离10-150KD的蛋白.请问:C以及浓缩胶和分离胶的Ｔ的选择依据是什么？我的实验该选择什么样的Ｃ和Ｔ效果比较好？谢谢！
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