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标题:【求助】离子交换层析

30moonriver[使用道具]
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发表于 2014-7-1 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】离子交换层析


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头痛
我有个头疼的问题需要解决：我从链球菌体内粗提的蛋白质（基本包括它所有的蛋白质），现在想要用离子交换进行分离纯化，几个问题：
1 我应该用PH?的缓冲夜，粗提物的等电点应该怎么确定 ？
2 应该用阴离子还是阳离子交换剂？
3 或者在分离粗提液时还有除了离子交换更好的方法，请指教！
谢谢！！
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nvdabing[使用道具]
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发表于 2014-7-1 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的一点小小的建议，
1.要看你的目的蛋白的等电点
2.蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此间的相反电荷集团的静电吸引这又和溶液的PH值有关。
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30moonriver[使用道具]
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发表于 2014-7-1 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的目的是，先把总蛋白的各个单个蛋白分离出来，或是先收集含量较高的几种单个蛋白，然后分析他们，因为不是单个蛋白，是混合蛋白，所以才很难确定缓冲液的等电点，也不知道怎么分离。
是不是要先用阴离子过一遍，先收集一些峰；再过阳离子，再收.可行吗？
初学者，真是一头雾水啊！
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xue258[使用道具]
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发表于 2014-7-1 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

比较困难，不知道你的实验条件怎样，都有什么样的凝胶。如果有阴离子介质，可以先取一毫升介质分别放入4个小试管里，再用pH为7，8，9，10的缓冲液分别平衡5次然后在每个试管中加入样品，样品的pH值要和相应试管的pH值对应。让样品充分和介质反应一段时间后，离心取上清，跑电泳。看看在不同pH条件下样品和介质的结合情况。阳离子介质的pH值可设为3, 4, 5, 6
和前面讲的方法一样。还可以先跑一个凝胶柱，把不同的分子量的组分分开，然后根据前面所掌握的蛋白在不同pH条件下的带电情况，进行离子交换层析。这些只是本人的一点参考意见。
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30moonriver[使用道具]
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发表于 2014-7-1 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢以上战友的建议！我心中大致有个想法了 ！！

如果用DEAE-Sepharose Fast Flow为阴离子交换剂 ，它的缓冲夜是应该用Tris-Hcl吧？我怎么见有的例子也有用PBS的？
还有，平衡完离心时转速应该是多少呢？
谢谢！
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发表于 2014-7-1 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
平衡完了后，用12000rpm离心10分钟。注意要在4度离心，防止蛋白在离心时发热降解了。
阴离子交换一般是用50mM的Tris-Hcl.
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jkobn[使用道具]
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发表于 2014-7-1 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
具体的配方查一下书，PBS一般用在阳离子交换层析，离心10000转就足够了。这个实验精度要求比较高，希望你能成功。
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-7-1 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得你首先应该先跑一个自然电泳，看看你的样品所带电荷主要是正电还是负电，然后再选用离子树脂。
我的课题与你的有点相近，提取的也是一个混合的粗提物，我先上的凝胶柱，筛选出我所需要的分子量范围，然后用离子树脂，基本能得到较纯的物质！
以上仅供参考！！大家一起努力！
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发表于 2014-7-1 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢这么多人关注！
原来也想着先用凝胶，但是觉得蛋白种类太多，柱子过起来很麻烦，而且我这个根本就不是筛选，只要是蛋白，能分离出来的，都会要的。还怕丢失成分。
请问sy1103:你说的自然电泳，能不能说得详细一点？
谢了！！
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gogo[使用道具]
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 小中大
我觉得我得课题和你的很相近，我也想试一下离子交换分离纯化，但对这方面很陌生，你打算如何进行离子交换啊？可否交流一下？
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