【求助】我的WB为什么总是转膜不上

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标题:【求助】我的WB为什么总是转膜不上

docsy[使用道具]
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发表于 2014-7-1 15:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在正在做关于脂质代谢酶类蛋白表达的试验，包括CPT-1以及PPARa。在蛋白提取过程中，我用了RIPA强裂解液裂解大鼠肝脏组织，想提取总蛋白，来做CPT-1(它是表达在膜蛋白上的)；然后配置低渗、高渗液提取核蛋白PPARa。在跑SDS-PAGE时每次染胶都非常漂亮，但是用100v,2h转膜却始终转不成功，丽春红染色后都是一片空白，只有溴酚兰印迹。请大家帮我讨论一下，我的问题到底是出在提取还是转膜？另外今天加了TAKARA的高分子量MARKER也没有转上，真是晕。操作应该没有太大问题的。大家帮帮我啊，谢谢了！！

49888[使用道具]
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发表于 2014-7-1 15:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的电转条件是湿转还是半干,如果是湿转,试试变换一下转膜条件,注意一下电转液中甲醇的量,因为它是用来洗脱蛋白上结合的SDS的,而SDS多了很可能就转不上膜.一般甲醇量在15%左右.另外PVDF膜要用甲醇浸透,并且平衡时间一定要够.

docsy[使用道具]
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发表于 2014-7-1 15:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢，我用的是湿转。转膜前是用甲醇活化PVDF膜。我得电转液是5*电移缓冲液200ml，甲醇200ml，600ml蒸馏水。这样还是转不上。

docsy[使用道具]
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发表于 2014-7-1 15:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们实验室其他人用的同样的电转液都能转上，我得5*电转液的配方是14.65g的甘氨酸，29.1g的Tris碱，1.85g的SDS，加水至1L.

8princess8[使用道具]
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发表于 2014-7-1 15:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1。"在跑SDS-PAGE时每次染胶都非常漂亮"，说明电泳没什么问题。
2。“实验室其他人用的同样的电转液都能转上",说明电转液没问题。
3。“TAKARA的高分子量MARKER也没有转上“，说明问题的确出在转膜上。
4。“100v,2h转膜“，时间、电压都没问题。
4。“转膜前是用甲醇活化PVDF膜“，膜处理没问题。
结论：
1。转膜电极反了，我也干过那样的事，当然转不到膜上。
2。转膜是否在低温下进行？

docsy[使用道具]
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发表于 2014-7-1 15:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们的电极是颜色对应，不会错的。而且是在冰中转膜的。你们认为我的蛋白提取会不会又问题？

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-7-1 15:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们实验室现在也出现了这样的问题,小分子量的能转过去,但是大分子量的蛋白转不过去,立春红染色也只能看到电泳泳道,看不到蛋白带,是不是SDS有问题呢?条件和实验操作步骤我认为没有问题,我实在想不出问题出在哪里了,
请问,SDS对整个实验过程影响有多大?

flower-201[使用道具]
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