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标题:【求助】为什么我的SDS-PAGE电泳要将近20小时

xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2014-7-4 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】为什么我的SDS-PAGE电泳要将近20小时

我做的是草的蛋白质的电泳SDS-PAGE,槽是六一厂的,用稳压,浓缩胶用80V(电流在10-20mA,分离胶150V(电流在10-20mA).其中浓缩胶用了5个小时,分离胶用了10个小时才跑了一半. 整个电泳槽置于冰块中,再通冷水,当把电泳槽从冰上拿出来时,发觉电泳槽的电极缓冲液面不断升高,电流由原来的10几上升到70多.
另外虽然调压到80或者150,但电泳仪电压总是上下波动2伏左右.
为什么要跑这么久呢,我第一次做恒压.
非常感谢!
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c86v[使用道具]
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发表于 2014-7-4 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做的一般都是5~6小时,最多8小时,但那是电压很低才会那么久啊,也没有20个小时这么长啊!根据你讲的情况,你先检查一下电极是否合适,有没有接触不良;其次,电泳槽的电泳缓冲液液面有升高,这种情况不会是有冰水进入到电泳槽了吧?改变了缓冲液的离子浓度,这个也可能影响电泳速度的.
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-7-4 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得你的running buffer出问题了，是不是用的次数太多，还是稀释的浓度不对，反正，强烈建议你换buffer。80V电流一般要40mA左右。要不就是你的电泳槽漏水，上下槽电流不是很通。
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nut6694[使用道具]
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发表于 2014-7-4 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你不会没有去掉封胶的橡胶条吧？！
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bring[使用道具]
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发表于 2014-7-4 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

"电泳槽从冰上拿出来时,发觉电泳槽的电极缓冲液面不断升高,电流由原来的10几上升到70多."--那就要问一下你了,你早冰浴电泳的时候,有没有观察过你的电极缓冲液是否已经没过了凝胶的界面了.也就是说在开始的时候你观察缓冲液已经过了界面了,可是当你放入冰浴后,由于受冷了收缩,液面下降厉害,使液面和凝胶有接触,可保持一定的电流通过,但是却不能维持恒定的高电压,拿出来后,液面恢复正常就可以了.所以建议你注意一下了.
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jujuba[使用道具]
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发表于 2014-7-4 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

觉得很有可能是running buffer得问题,你有没有看跑的时候电流是多大啊?
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-7-4 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
出现这种情况要考虑几个方面，一是凝胶的配制，可能其中有成分发生了变化，建议重新配凝胶（包括各种组成液如Tris HCl等）；二是电流Buff可有有问题，要重配试一下；三是电泳 过程中出了问题，建议电泳时密切观察，应该可以发现问题。其实SDS-PAGE关键是液体的问题，有一个地方出了问题，可能就有意想不到的结果。
祝你好运！
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xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2014-7-4 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的一般都是5~6小时,最多8小时,但那是电压很低才会那么久啊,也没有20个小时这么长啊!根据你讲的情况,你先检查一下电极是否合适,有没有接触不良;其次,电泳槽的电泳缓冲液液面有升高,这种情况不会是有冰水进入到电泳槽了吧?改变了缓冲液的离子浓度,这个也可能影响电泳速度的.

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谢谢的你回复>>>>>>>>
电极怎么才算接触不良?在加冰的过程中是有冰块进入缓冲液,但不多,我觉得应该影响不大.
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xiaoxiaoniao[使用道具]
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 小中大
我觉得你的running buffer出问题了，是不是用的次数太多，还是稀释的浓度不对，反正，强烈建议你换buffer。80V电流一般要40mA左右。要不就是你的电泳槽漏水，上下槽电流不是很通。

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同样感谢你的回复.
我正极的缓冲液是用过一次,但在这次用之前我用PH计测其值,没发现变化,况且我负极那边的电极缓冲液是新配的;我80V的电流只有十多;在电泳是我发现正极的缓冲液有渗漏.
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xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2014-7-4 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你不会没有去掉封胶的橡胶条吧？！

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同样感谢你回复.
但我不知道什么是封胶的橡皮条,好象没这东西!
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