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标题:【求助】蛋白质表达最优条件的摸索

vera+[使用道具]
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【求助】蛋白质表达最优条件的摸索


郁闷!我的课题刚刚开始,首先要摸索一种重组蛋白表达的最优条件,重组菌是老师给的,我按照《分子克隆》所描述进行操作:增菌到对数生长期、选择不同浓度的IPTG分组诱导,结果SDS-PAGE没有显示出我要的蛋白,老师说我的蛋白之所以没有表达是因为我用试管摇菌,应该用锥形瓶的。她的意思我明白,锥形瓶可以提供更大的细菌生长空间,可是我用试管摇菌,只有5ml的菌液,对蛋白质的表达影响不至于会这么大吧。我怀疑可能是细菌有问题。有经验的大侠请不吝赐教:蛋白质最优条件的摸索每次摇多少菌液?用试管还是锥形瓶?二者影响有多大?
心急如焚!
谢谢!
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qqq111[使用道具]
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以下是我们的做法,供你参考(已经成功表达多个基因):
1.挑单克隆放入离心管中37度摇过夜(5ml左右即可)
2.过夜菌液按1:100稀释继续摇到对数中期(测OD值)
3.加IPTG诱导3-4小时
4.收集菌体,电泳.
其中第一步用试管即可,以下的步骤建议你用锥形瓶或烧瓶,具体用多大的瓶原则上按照:所摇的液体不超过瓶体积的20%,即1000ML的烧瓶别超过200ML.摇床转速一般在200转/分以上最好.
具体到条件的优化,最主要的是诱导时的温度(第3步),他关系到可溶性表达比例的高低,IPTG的浓度影响不是太大,因为你现在不表达,建议你用一个IPTG浓度(0.2-0.6都行)实验就行了,先确定到底表不表达,再考虑优化条件.
  当然,每个基因不同所需的表达条件也不同,最终需要你自己摸索.
GOOD LUCK!
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vera+[使用道具]
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谢谢你!我诱导时用的是15ml左右的试管,50ul菌液加入5ml培养基啊
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tie8[使用道具]
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摇菌时瓶的底面积大小是比较重要的,试管底的面积太小了,我建议你把量做大点,反正程序是一样的,做的量少也不省事,烧瓶也就几快钱,如果还没结果估计上游出问题的可能性比较大了,基因不表达的理由可是有若干条啊,只能仔细分析了,呵呵。
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831226[使用道具]
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我认为你可以自己试着摸索一下你蛋白的最优化条件,因为不同的蛋白的表达条件都是不一样的。下面说一下我的蛋白(表达菌BL21)的表达条件:
1,将转化后的平板中挑单个菌落,放3ml培养液中37度摇过夜。
2,按1:100取50ul加入到五支分别盛有5ml培养基的试管中,摇至OD值为600,然后分别加IPTG至终浓度分别为0.2,0.6,0.8,1.0,1.2,摇菌4小时,然后分别跑胶看表达量。
3,然后按IPTG最优化条件,再分别按1:10,1:50,1:100,1:150,1:200,然后摇菌4小时,然后跑胶看表达量。
4,按IPTG和取菌量最优化条件分别加IPTG分别摇1小时,2小时,3小时,4小时,5小时,分别跑胶看表达量。
经过这几个步骤你就能综合出,你蛋白表达的最优化条件,大概需要三四天的时间吧。
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vera+[使用道具]
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3,然后按IPTG最优化条件,再分别按1:10,1:50,1:100,1:150,1:200,然后摇菌4小时,然后跑胶看表达量。
艳过刘痕,逆-上面所说的比例是指什么?谢谢!
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831226[使用道具]
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比例就是摇菌前所加的菌量和培养液的比例
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vera+[使用道具]
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我又做了一轮实验,结果SDS-PAGE的结果显示的蛋白并不是我需要的分子量,我的目的蛋白分子量在21kd左右,可是电泳得到的新条带分子量在120kd附近,难道是形成包涵体了吗?还可能是什么原因?请各位有经验的老师指点迷津。
谢谢
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hold住[使用道具]
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你的重组质粒的宿主菌是BL21吗?
你可以重新提取质粒,看看菌里的质粒还在不在了,是不是在保存过程中质粒丢失了;提出的质粒可以送去测序,看看是不是你要的质粒,有没有突变;同时可以把提出的质粒重新转化一次,再做诱导表达。
个人意见,仅供参考
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vera+[使用道具]
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谢谢!我只是做下游的蛋白质表达和纯化以及单抗制备,上游的工作是另一个人做的
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