小中大【求助】作过磷酸化p38westernblot的请帮忙
最近在作p-p38的westernblot，但一直没有结果。希望作过的朋友帮帮忙，临近毕业，还差这一个指标，真的希望能赶快结束实验。先谢谢了！
我是用过氧化氢作用不同的时间点分别为0，5，10，15，30，60min。（文献报道在10min，15min，30min都有高表达，但60min可能下降）收集细胞，用碧云天的裂解液裂解（没有NaF,但有NaVO3)电泳转膜都没问题，因为电泳后部分染色了，转膜后部分作了actin，量很高，所以我认为到转膜应该没问题，蛋白量也够了。后面我用BSA和脱脂奶粉都封闭过，室温1.5小时，37度1小时都试过，一抗，二抗均是中杉santa分装的，一抗用1：200（推荐1：100－1：1000）TBST洗膜，二抗用1：1000（推荐1：1000－1：5000），TBS洗膜，ECL plus显色。第一次做的时候，用的是BSA封闭，整个膜都很黑，但好像隐约能看见条带，但后来就再没出过条带。
好着急呀！那位用过这个抗体的望指教！我是不是应该在裂解液里加点NaF呀！
